ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ เรื่อง กำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : การชันสูตรโรคนิวคาสเซิล ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551

ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ เรื่อง กำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : การชันสูตรโรคนิวคาสเซิล ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551 ด้วยคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร เห็นสมควรกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร เรื่อง การชันสูตรโรคนิวคาสเซิล เป็นมาตรฐานทั่วไป ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551 เพื่อส่งเสริมสินค้าเกษตรให้ได้คุณภาพ มาตรฐาน และปลอดภัย อาศัยอานาจตามความในมาตรา 5 มาตรา 15 วรรคสอง และมาตรา 16 แห่งพระราชบัญญัติ มาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551 ประกอบมติคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร ในการประชุม ครั้งที่ 4/2565 เมื่อวันที่ 23 พฤศจิกายน 2565 รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ จึงออกประกาศกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : การชันสูตรโรคนิวคาสเซิล มา ตรฐานเลขที่ มกษ. 10304 - 2566 ไว้เป็นมาตรฐานทั่วไป ดังมีรายละเอียดแนบท้ายประกาศนี้ ทั้งนี้ ให้ใช้บังคับตั้งแต่วันถัดจากวันประกาศในราชกิจจานุเบกษาเป็นต้นไป ประกาศ ณ วันที่ 1 0 มกราคม พ.ศ. 25 6 6 ประภัตร โพธสุธน รัฐมนตรีช่วยว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ปฏิบัติราชการแทน รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ้ หนา 29 ่ เลม 140 ตอนพิเศษ 78 ง ราชกิจจานุเบกษา 31 มีนาคม 2566

มกษ. 10304 - 2566 มาตรฐานสินค้าเกษตร การชันสูตร โรคนิวคาสเซิล 1. ขอบข่าย มาตรฐานสินค้าเกษตรนี้ กาหนดการชันสูตร โรคนิวคาสเซิล ครอบคลุมตั้งแต่ การเก็บ ตัวอย่าง การ รักษา ตัวอย่าง เพื่อการชันสูตร การตรวจหาและจาแนกเชื้อ รวมถึง การตรวจการตอบสนอง ทางภูมิคุ้มกัน 2 . นิยาม ความหมายของคาที่ ใช้ในมาตรฐานสินค้าเกษตรนี้ มีดังต่อไปนี้ 2.1 โรคนิวคาสเซิล ( Newcastle disease ; ND ) หมายถึง โรคที่มีสาเหตุจากการติดเชื้อ avian paramyxovirus type 1 ( APMV - 1) หรือ เรียกว่า เชื้อ Newcastle disease virus (NDV) สายพันธุ์ รุนแรง 2.2 สัตว์ปีก ( avian) หมายถึง สั ตว์ใน ชั้น Aves เช่น ไก่ ไก่งวง เป็ด ห่าน นกกระทา นกพิราบ นกป่า นกสวยงาม 2.3 การชันสูตรโรค ( diagnosis) หมายถึง การตรวจสอบเพื่อหาสาเหตุหรือหลักฐานข้อเท็จจริง ประกอบการวินิจฉัยโรค 2.4 ตัวอย่างควบคุมผลบวก ( positive control sample) หมายถึง ตัวอย่างที่มีเชื้อ ส่วนประกอบของเชื้อ หรือแอนติบอดีต่อเชื้อ ซึ่งเมื่อนำไปผ่านกระบวนการทดสอบ ควบคู่กับ ตัวอย่างที่ต้องการ ทดสอบแล้วให้ผลบวก 2.5 ตัวอย่างควบคุมผลลบ ( negative control sample) หมายถึง ตัวอย่างที่ไม่มีเชื้อ ส่วนประกอบ ของเชื้อ หรือแอนติบอดีต่อเชื้อ ซึ่งเมื่อนำไปผ่ำน กระบวนการทดสอบ ควบคู่ กับ ตัวอย่าง ที่ต้องการทดสอบแล้วให้ผลลบ 2.6 รอยโรค ( lesion) หมายถึง พยาธิสภาพหรือลักษณะผิดปกติที่ปรากฏในเนื้อเยื่อหรืออวัยวะ

มกษ. 10304 - 256 6 2 3. การชันสูตรโรค การชันสูตรโรค นิวคาสเซิล โดยใช้วิธี ทางห้องปฏิบัติการ ที่แนะนาในมาตรฐานนี้ เป็น วิธีชันสูตร ที่ป ระกาศโดยองค์การสุขภาพสัตว์โลก ( World Organisation for Animal Health; WOAH ) ทั้งนี้ ห้องปฏิบัติการอาจใช้วิธีการชันสูตรที่มีรายละเอียดขั้นตอนการปฏิบัติที่แตกต่างออกไปได้ แต่ต้องเป็นไปตามหลักเกณฑ์ ดังนี้ 1) เป็นวิธีชันสูตรที่ตีพิมพ์ในเอกสารคู่มือหรือวารสารทา งวิชาการที่เป็นที่ยอมรับในระดับ ระหว่างประเทศ 2) เป็นวิธีชันสูตรที่มีผลการประเมินความใช้ได้ ( validation) โดยการศึกษาร่วมกัน ระหว่าง ห้องปฏิบัติการ ( collaborative study) ตามหลักเกณฑ์ที่เป็นที่ยอมรับในระดับระหว่างประเทศ 3) กรณี ไม่ มีวิธีชันสูตรตาม 1 ) หรือ 2 ) ให้ ใช้วิธีชัน สูตรที่ได้ป ระเมิน ความ ใช้ได้ โดยห้องปฏิบัติการเดียว ( single laboratory validation) ที่มีระบบคุณภาพ และปฏิบัติตาม หลักเกณฑ์ ประเมินความใช้ได้ ที่เป็นที่ยอมรับในระดับระหว่างประเทศ รายละเอียดของโรคนิวคาสเซิลด้าน วิทยาการระบาด อาการ และ พยาธิวิทยา ของโรคนิ วคาสเซิล ให้ไว้เป็นข้อมูล ใน ภาคผนวก ก เชื้อ APMV - 1 เป็น เชื้อ ไวรัสที่มีความเสี่ยงสูงในการแพร่กระจายของเชื้อภายในห้องปฏิบัติการ ดังนั้น การชันสูตรโรค นิวคาสเซิล ควรดาเนินการในห้องปฏิบัติการชีวนิรภัย ตั้งแต่ระดับที่ 2 (Biosafety Level 2; BSL2) ขึ้นไป ซึ่งมีความ พร้อม ทั้งสถานที่ เครื่องมือเครื่องใช้ วัสดุอุปกรณ์ และ ระบบกา ร ปฏิบัติงาน รวมทั้ง บุคลากร ที่เป็นไปตาม การ ปฏิบัติ ที่ดีใน ห้องปฏิบัติ การ (good laboratory practice) 3. 1 การเก็บและรักษาตัวอย่างเพื่อการชันสูตร 3 . 1 . 1 การเก็บตัวอย่างจาก สัตว์ปีก มีชีวิต ควร เลือก สัตว์ ปีก ที่เริ่มแสดงอาการป่วย โดยเก็บตัวอย่าง อย่างใดอย่างหนึ่ง หรือหลายอย่างร่วมกัน ดังต่อไปนี้ 1) ป้ายเชื้อจาก ท่อลม ( tracheal swab ) หรือ ป้ายเชื้อจาก คอหอยส่วนปาก ( oropharyngeal swab) ควบคู่กับ ป้ายเชื้อจากช่องทวารร่ วม ( cloacal swab) โดย ให้มี มูลสัตว์ปีก ติดมาด้วย ทั้งนี้ การป้ายเชื้อ ควร ใช้สาลี หรือใยสังเคราะห์ พันปลายลวดเส้นเล็ก หรือใช้ ก้านพลาสติกพันสาลี หรือใยสังเคราะห์ ที่สะอาดและปลอดเชื้อ 2 ) มูล สัตว์ปีก สด 3 ) ซีรัม 3. 1 . 2 การเก็บตัวอย่างจาก ซากสัตว์ปีก ซึ่งได้ จากสัตว์ปีกที่เพิ่งตาย หรือสัตว์ปีกที่ใกล้ตาย ( moribun d ) โดย มีการทา การุณยฆาต เก็บตัวอย่างอย่างใดอย่างหนึ่ง หรือหลายอย่างร่วมกัน ดังต่อไปนี้ 1) ของที่อยู่ภายในลาไส้ ซึ่งรวม มูล สัตว์ปีก 2) ป้ายเชื้อจากช่องทวารร่ วม ควบคู่กับ ป้ายเชื้อจากคอหอยส่วนปาก หรือ ป้ายเชื้อจากท่อลม

มกษ. 10304 - 256 6 3 3) ปอด 4) ถุงลม 5) ลาไส้ 6) ม้าม 7) ไต 8) ทอนซิลไส้ตัน 9) สมอง 10) ตับ 11) หัวใจ 3. 1 . 3 การเก็บรักษาตัวอย่าง เนื้อเยื่อ ตัวอย่าง ป้ายเชื้อ ตัวอย่าง มูล สัตว์ปีก และ ตัวอย่าง ของที่อยู่ ภายในลาไส้ : 1) เก็บตัวอย่าง เนื้อเยื่อ และตัวอย่าง ป้ายเชื้อจากคอหอยส่วนปาก หรือตัวอย่าง ป้ายเชื้อจากท่อลม ใน สารละลาย isoton ic phosphate buffered saline (PBS) pH 7.0 - 7.4 ที่ ใส่ ยาปฏิ ชีวนะ ได้แก่ เพนิซิลลิน (2,000 U / ml ) สเตรปโตไมซิน (2 mg/ml ) เจนทา มิซิน ( 50 μg / ml ) และ ไมโคสตาติน (1,000 U / ml ) จากนั้นปรับสารละลายภายหลังการเติมยาปฏิชีวนะให้มี pH 7.0 - 7.4 2) สาหรับ ตัวอย่าง มูล สัตว์ ปีก ตัวอย่าง ของที่อยู่ภายในลาไส้ และตัวอย่าง ป้ายเชื้อจากช่องทวารร่ วม ให้เพิ่มความเข้มข้นของยาปฏิชีวนะสูงขึ้ นอีก 5 เท่าจากความเข้มข้น ตาม 1) จากนั้นปรับ สารละลายภายหลังการเติมยาปฏิชีวนะให้มี pH 7.0 - 7.4 3) ควร ดาเนินการกับตัวอย่างสมองก่อน และควร มีการ แยก เก็บ เพื่ อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้าม กับเนื้อเยื่ออื่น เนื่องจากการพบเชื้อไวรัสในสมองอาจเป็นตัวชี้วัดของโรคนิวคาสเซิลสายพันธุ์ รุนแรง 4) สามารถรวม ตัวอย่างป้ายเชื้อ จากตาแหน่งทางกายวิภาคเดียวกัน (เช่น รวม ตัวอย่าง ป้ายเชื้อ จากช่องทวารร่ วม หรือ รวม ตัวอย่างป้ายเชื้อจากคอ หอยส่วนปาก ) และส่วนมากจะรวม 5 ตัวอย่างเป็น 1 ตัวอย่าง 5 ) ให้ เก็บรักษา และส่ง ตัวอย่าง ใน 1 ) และ 2 ) ที่อุณหภูมิ 4 - 8 ◦ C ไปยัง ห้องปฏิบัติการภายใน 12 ชั่วโมง หากไม่สามารถส่งตัวอย่างภายในวันที่เก็บตัวอย่างได้ ให้แช่แข็งตัวอย่างในน้าแข็งแห้ง หรือตู้แช่ที่อุณหภูมิ - 20 ◦ C หรือต่ากว่า แล้วนาส่งห้องปฏิบัติการ ภายใน 72 ชั่วโมง 3.1.4 การเก็บรักษาตัวอย่าง ซีรัม เก็บเลือด ปริมาตร 1 - 3 ml ในหลอดเก็บเลือด ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง นาน 30 นาที เพื่อให้ ซีรัมแยกชั้น ให้ เก็บรักษา และส่ง ตัวอย่าง ซีรัม ที่อุณหภูมิ 4 - 8 ◦ C ไปยัง ห้องปฏิบั ติการภายใน 12 ชั่วโมง หากไม่สามารถส่งตัวอย่าง ซีรัม ภายในวันที่เก็บตัวอย่างได้ ให้แช่แข็งตัวอย่าง ซีรัม ใน น้าแข็งแห้ง หรือตู้แช่ที่อุณหภูมิ - 2 0 ◦ C หรือต่ากว่า แล้วนาส่งห้องปฏิบัติการ ภายใน 72 ชั่วโมง

มกษ. 10304 - 256 6 4 3.1. 5 กรณี การ เก็บรักษา ตัวอย่างป้ายเชื้อ ใน transport media t ransport media สาหรับ เก็บ ตัวอย่างป้ายเชื้อ เพื่อรักษาเชื้อไวรัส ควรมีโปรตีน เช่น brain – heart infusion หรือ ซีรัมโค ไม่เกิน 5% ( v/v ) หรือ อัลบู มิน โค 0.5% ( w/v ) หรือ ใช้ transport media สาเร็จรูป ทางการค้า ที่เหมาะสม 3. 2 การชันสูตรโรค นิวคาสเซิล วิธีการชันสูตร โรคนิ วคาสเซิล แบ่งออกได้เป็น 2 วิธีการหลัก คือ การตรวจหาและจาแนกเชื้อ ( detection of the agent) และการตรวจการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ( detection of immune response ) ทั้งนี้ สามารถเลือกใช้วิธีการชันสูตรที่แนะนาไว้ โดยขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ตามหลัก วิทยาการระบาด วิธี กำรตรวจหาและจำแนกเชื้อ ที่แนะนาในมาตรฐานนี้ คือ วิธีการเพาะแยกเชื้อไวรัส ( virus isolation) เพื่อ ตรวจหา เชื้อ วิธีการทดสอบคุณสมบัติการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง ( haemagglutination; HA) เพื่อจาแนกเชื้อ วิธีการหาค่าดัชนีการก่อโรค ( pathogenicity index ) โดย การฉีดเชื้ อเข้าสมอง ( intracerebral pathogenicity index; ICPI) วิธีจำแนกความก่อโรคโดยใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุล ( molecular basis for pathogenicity ) วิ ธี reverse transcription - polymerase chain reaction (RT - PCR) วิธี r eal - time RT - PCR และ วิธีการหาลาดับยีน ( gene sequencing) วิธี การตรวจการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ที่แนะนาในมาตรฐานนี้ คือ วิธีการยับยั้งการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดง ( haemagglutination inhibition; HI) และ วิธี enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA) 3. 2 . 1 วิธีการเพาะแยกเชื้อไวรัส ( virus isolation) วิธีการเพาะแยกเชื้ อไวรัสในมาตรฐานฉบับนี้ คือ การฉีดเชื้อไวรัสเข้าในไข่ไก่ฟัก ทั้งนี้ สาหรับ เหตุผลด้านสวัสดิภาพสัตว์ ควรใช้ไข่ไก่ฟัก จำนวน น้อยที่สุด เท่าที่จาเป็น วิธีการเพาะแยกเชื้อไวรัส มีขั้นตอน ดังนี้ 3.2.1.1 การเตรียมตัวอย่าง : 1 ) สาหรับ ตัวอย่างมูลสัตว์ปีก หรือ ตัวอย่างป้ำยเชื้อ ให้ เขย่าแรงๆ ด้วย vortex mixer ให้เป็น suspension 2) สาหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อ ให้ ตัด ตัวอย่าง เป็นชิ้นเล็กๆ ประมาณ 1 g แล้วนาไป บดในโกร่งบด โดยใช้ทรำ ยละเอียดช่วยในการบด ใส่ สารละลาย PBS ปริมาตร 5 - 10 ml คนให้เข้ากัน ให้เป็น suspension 3 ) นำ suspension ที่ ได้ จาก 1 ) และ 2 ) ไป ปั่นเหวี่ยงที่ความ เร่ง 1 , 000 g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิไม่เกิน 25 ◦ C แล้ว เก็บ ส่วนใส ไปทดสอบ

มกษ. 10304 - 256 6 5 4) กรณีที่ตัวอย่างมีการปนเปื้อน เชื้อแบคทีเรีย สามารถจัดการกับตัวอย่างที่มีการปนเปื้อน โดยการเติมยาปฏิชีวนะ ได้แก่ เจนทามิซิน ( 1 mg/ml ) เพนิ ซิลลิน จี ( 10,000 U/ml ) และ แอมโฟเทอริซิน บี ( 20 μg/ml ) และนาไปบ่ม เป็นเวลา 2 - 4 ชั่วโมง สาหรับตัวอย่างที่มีการปนเปื้อน เชื้อ แบคทีเรีย อย่างมาก ได้แก่ ตัวอย่างมูลสัตว์ปีก ตัวอย่าง ของที่อยู่ภายในลาไส้ และตัวอย่างป้ายเชื้อจากช่องทวาร ร่วม และไม่สามารถ ลดการปนเปื้ อน โดยการปั่นเหวี่ยงหรือการเติมยาปฏิชีวนะ ได้ สามารถนำตัวอย่างไปกรองด้วยแผ่นกรอง ที่ความละเอียด 0.45 ไมครอน หรือ 0.2 ไมครอน ทั้งนี้ ควรใช้การกรองในกรณีที่ใช้วิธีอื่นๆ แล้วไม่ สามารถลดการปนเปื้อนได้เท่านั้น 3.2.1.2 การคัดเลือกไข่ไก่ฟัก : 1) ควรเลือกใช้ไข่ไก่ฟั กชนิดปลอดเชื้อ จาเพาะ ( specific pathogen free ; SPF ) หรือ ไข่ไก่ฟัก ที่ ไม่มีแอนติบอดีต่อ เชื้อ APMV - 1 ( specific antibody negative; SAN ) 2) ใช้ไข่ไก่ฟักอายุ 9 - 11 วัน จำนวน 3 - 5 ฟองต่อ 1 ตัวอย่าง 3.2 .1.3 การเตรียมไข่ไก่ฟัก : 1 ) คัดเอาไข่ ไก่ฟัก ที่เปลือกไข่มีรอย แตกร้าวออก 2 ) วางไข่ ไก่ฟัก โดยให้ด้านป้านอยู่ด้านบน จากนั้นใช้อุปกรณ์ส่องไข่ไก่ฟัก คัดเอาไข่ ไก่ฟัก ที่มี เชื้อตายหรือไม่มีเชื้อออก 3 ) นา ไข่ไก่ฟักที่มีเชื้อและมีความสมบูรณ์ ไปขีดเส้นตามแนว ช่องอากาศ ของไข่ ไก่ฟัก 4 ) ทาความสะอาดไข่ไก่ฟัก ตั้งแต่แนว ช่องอากาศ ขึ้น ไปด้วยแอ ล กอฮอล์ 7 0 % จากนั้นเช็ดด้วย โพวิโดนไอโอดีน 5) เจาะรูที่เปลือกไข่ ในบริเวณที่ ห่างจาก ช่องอากาศ ประมาณ 0.5 cm โดย ใช้เข็มเบอร์ 18 ยาว 1 นิ้ว 3.2.1.4 การฉีด ตัวอย่าง เข้าไข่ไก่ฟัก : 1 ) ดูดตัวอย่าง ปริมาตร 0.2 ml และฉีด ตัวอย่างลงใน allantoic cavity ของไข่ ไก่ฟัก โดย ให้ ปลายเข็มลึกไปในเปลือกไข่ประมาณ 1 cm 2 ) ปิด รู ที่ฉีดด้วย กาว เพื่อไม่ให้มีการ ปนเปื้อน 3 ) นาไข่ ไก่ ฟักที่ฉีด ตัวอย่าง แล้วเข้าตู้ฟักที่อุณหภูมิ 35 - 37 ◦ C เป็นเวลา 2 - 7 วัน ที่ ความชื้น สัมพัทธ์ประมาณ 66 - 70 % และตรวจดูการมีชีวิตของไข่ไก่ฟัก ทุกวัน โดยใช้อุ ปกรณ์ส่องไข่ 3.2.1.5 การตรวจการติดเชื้อในไข่ไก่ฟัก : 1 ) เมื่อผ่านไปครบ 24 ชั่วโมง ให้นาไข่ไก่ฟักมาตรวจดูการมีชีวิตของตัวอ่อน โดยใช้อุปกรณ์ ส่องไข่ และ คัดเอาไข่ไก่ฟักที่ ตัวอ่อน ตายออก ส่วนไข่ ไก่ฟัก ที่เหลือนำไป ตรวจดูการมีชีวิต ของตัวอ่อน อีกครั้ง ทุกวันจนครบระยะ เวลาที่กาหนด 2 ) สาหรับไข่ไก่ฟักที่พบ ตัวอ่อนตายหรือตัวอ่อนแห้ง หลังการฉีด ตัวอย่าง 24 ชั่วโมง และไข่ไก่ฟัก ทั้งหมดที่ ตัวอ่อนยังมีชีวิตอยู่จนครบระยะเวลาในการฟัก ให้นำไปแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4 ◦ C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หรือทิ้งไว้ ตลอดทั้งคืน เพื่อรอการเก็บ allantoic f luid ต่อไป

มกษ. 10304 - 256 6 6 3.2.1.6 การเก็บตัวอย่าง allantoic fluid : 1 ) ทาความ สะอาดไข่ไก่ฟัก โดยเฉพาะบริเวณ ช่องอากาศ ด้วย แอ ล กอฮอล์ 70 % 2 ) ตัดเปลือกไข่รอบ ช่องอากาศ โดยใช้กรรไกรตัดเนื้อเยื่อ จากนั้นใช้ ปากคีบ คีบเยื่อไข่แล้วเปิด เยื่อไข่ออก จากนั้นใช้ พาสเจอร์ปิเปต ดูด allantoi c fluid หรือใช้เข็มเจาะเปลือกไข่และดูด allantoic fluid ออกมา เก็บใส่ หลอดเซนติฟิว ขนาด 15 ml แล้วนำไปทดสอบด้วยวิธี HA หากได้ผล HA เป็นลบใน passage ที่ 1 ให้ดำเนินการต่อใน passage ที่ 2 โดย นำ allantoic fluid ที่ได้ไปเจือจางในอัตราส่วน 1/5 หรือ 1/10 ใน สารละลำย PBS หรือ อาหารเลี้ยงเซลล์ ที่ผสมยาปฏิชีวนะ แล้วนาไปฉีดเข้าในไข่ไก่ฟัก และให้ดาเนินการตามขั้นตอนต่างๆ ข้างต้น 3) เก็บตัวอย่าง allantoic fluid แล้วนาไป ทดสอบด้วยวิธีการอื่นๆ หรือนาไป แช่แข็งที่อุณหภูมิ - 20 ◦ C หรือ - 80 ◦ C 3.2. 2 วิธีการทดสอบคุณสมบัติการเกาะกลุ่ มของเม็ดเลือดแดง ( haemagglutination; HA) วิธี HA เป็นการตรวจหาหรือวัดระดับความเข้มข้นของแอนติเจนที่มีคุณสมบัติเฉพาะ ในการเกาะกลุ่มเม็ดเลือดแดงที่ เข้าคู่ กันให้ตกตะกอนได้ แอนติเจนที่มีคุณสมบัตินี้พบได้ ในเชื้อไวรัสบางชนิด เช่น เชื้อ APMV - 1 มี surface projec tions อยู่บริเวณ envelope ซึ่งเป็น แอนติเจน ที่สามารถจับกับ ตัวรับ ( receptor site ) ของเม็ดเลือดแดงและตกตะกอนได้ วิธีการเตรียมเม็ดเลือดแดงไก่ มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) เจาะเลือดไก่ ที่ปลอดจากแอนติบอดีเฉพาะต่อเชื้อ APMV - 1 อย่างน้อย 3 ตัว ใส่ใน สารละลายอัลซีเวอร์ ( Als ever ’ s solution) ในอัตราส่วน 1:1 2 ) ล้ำงเม็ดเลือดแดง 3 ครั้ง ด้ วย สารละลาย isotonic PBS (0.01 M) โดยการปั่ นเหวี่ยง ที่ ความเร่ง 800 g เป็นเวลา 5 นาที และปรับสารละลายให้มี pH 7.0 - 7. 2 3 ) ปรับความเข้ มข้ นของเม็ดเลือดแดง ที่เตรียมไว้ไม่นาน เกิน 1 สัปดาห์ ให้ มีควำมเข้ มข้ น 1 % ( v/v ) ใน สารละลาย PBS วิธี HA มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) ใส่สารละลาย PBS ปริมาตร 0 .025 ml ลงในเพลต ( microtitre plate) ที่มีก้นหลุม เป็นรูป ตัววี ( V) หรือตัวยู ( U ) 2 ) เติม virus suspension ( allantoic fluid ) ปริมาตร 0 .025 ml ลงในหลุมแรกของเพลต 3 ) เจือ จาง virus suspension เชิงอนุกรม 2 เท่า ( two - fold dilutions ) ด้วยปริมาตร 0.025 ml ทุกหลุม ยกเว้นหลุมสุดท้าย ซึ่งเป็นหลุมควบคุมเม็ดเลือดแดง 4 ) เติมสารละลาย PBS ปริมาตร 0 .025 ml ในทุกหลุม 5 ) เติมเม็ดเลือดแดงไก่ 1 % ( v/v) ปริมาตร 0 .025 ml ลงในทุกหลุม 6 ) เคาะ เพลตเบาๆ ให้ผสมเข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ เป็นเวลา 40 นาที ที่อุณหภูมิ ห้อง หรือ เป็นเวลา 60 นาที ที่อุณหภูมิ 4 ◦ C จะพบว่าเม็ดเลือดแดงในหลุมควบคุมจะรวมตัวกันที่ก้นหลุม และมีลักษณะ คล้ายเม็ดกระดุม

มกษ. 10304 - 256 6 7 7 ) เมื่อครบเวลา นาเพลตมาตรวจสอบหลุมของ virus suspension ที่เกิดปฏิกิริ ยาการเกาะกลุ่ม ที่สมบูรณ์ของเม็ดเลือดแดง 8 ) ประเมิน การเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง จากการเอียงเพลต โดย จะ พบหรือไม่พบ การไหลย้อย ของเม็ดเลือดแดงมีลักษณะคล้ายหยดน้าตา และ พิจารณาระดับไตเตอร์ได้จากความ เจือจาง สูงสุดที่เกิด การเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง อย่างสมบูรณ์ ( ไม่พบ กำรไหลย้อยของเม็ดเลือดแดง ) โดยนับเป็น 1 HA unit (HAU) และสามารถคานวณระดับไตเตอร์อย่างถูกต้องได้จาก ระดับ การเจือจาง เริ่มต้น 9) การ อ่านและแปลผล ก) ผลบวก หมายถึง มีเชื้อ APMV - 1 ใน allantoic fluid ไปทำ ปฏิกิริยา กับ เม็ดเลือดแดง ทาให้เกิดปฏิกิริยา การเกาะกลุ่ม ข) ผลลบ หมายถึง ไม่มีเชื้อ APMV - 1 ใน allantoic fluid ไปทา ปฏิกิริยา กับ เม็ดเลือดแดง ทาให้ไม่เกิดปฏิกิริยา การเกาะกลุ่ม 3.2. 3 วิธีการหาค่าดัชนีการก่อโรค ( pathogenicity index ) โดยการฉีดเชื้อเข้าสมอง ( intracerebral pathogenicity index; ICPI) เชื้อ APMV - 1 มีค วามรุนแรงที่แตกต่างกันสูง และมีการใช้วัคซีนเชื้อเป็นอย่างแพร่หลาย ทำให้ไม่สามารถยืนยันการติดเชื้อ APMV - 1 จากสัตว์ปีกที่แสดงอาการทางคลินิกได้ ดังนั้น จึงต้องมีการประเมินความรุนแรงของเชื้อ APMV - 1 ที่แยกได้ ปัจจุบันจะดำเนินการ หาค่าดัชนีการก่อโรค โดยใช้ วิธี การฉีดเชื้อเข้าสมอง ( intracerebral pathogenicity index; ICPI) ในการประเมินความรุนแรงของเชื้อไวรัส ทั้งนี้ วิธี ICPI จะใช้ใน บางสถานการณ์ทาง วิทยาการระบาด เช่น กรณีที่เป็นการแยกเชื้อไวรัสครั้งแรกจากการ ระบาด ของโรค ( index case ) แต่ไม่เหมาะสาหรับการแยกเชื้อไวรัส ในการเฝ้าระวังโรคในสัตว์ปีกสุขภาพดี ที่ไม่ได้รับวัคซีน วิธีการหาค่าดัชนีการก่อโรค โดยใช้วิธีการฉีดเชื้อเข้าสมอง มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) นำ allantoic fluid ที่มีเชื้อ APMV - 1 จาก ไข่ไก่ฟักที่ปลอดจาก เชื้อไวรัสอินฟลูเอนซา เอ ( influenza A ) และ มี HA titre มากกว่า 2 4 (มากกว่า 16 ) มา เจือจางด้วยสารละลาย sterile isotonic saline ในอัตราส่วน 1:10 โดยไม่มีวัตถุเจือปน เช่น ยาปฏิชีวนะ 2 ) ฉี ด allantoic fluid ที่ มี เชื้อ APMV - 1 ป ริมำต ร 0 .0 5 ml เข้าที่ ส ม อ งลู ก ไก่ SPF อายุ 24 - 40 ชั่วโมง จำนวน 10 ตัวต่อเชื้อไวรัส จำนวน 1 ตัวอย่าง 3 ) ตรวจตัวลูกไก่ทุกๆ 24 ชั่วโมง เป็นเวลา 8 วัน 4) บันทึกผลรายวัน โดยให้คะแนน ดังนี้ ก) คะแนน 0 หมายถึง ลูกไก่แสดงอาการปกติ ข) คะแนน 1 หมายถึง ลูกไก่แสดงอาการป่วย ค) คะแนน 2 หมายถึง ลูกไก่ตาย

มกษ. 10304 - 256 6 8 ทั้งนี้ ลูกไก่ที่ยังมีชีวิต แต่ไม่สามารถกินอาหารหรือน้าไ ด้ ให้ทา การุณยฆาต และให้คะแนน 2 ในวันถัดไป สาหรับลูกไก่ที่ตายจะให้คะแนน 2 ไปจนถึงวันสุดท้ายของการบันทึกผล 5 ) ICPI คือ ดัชนีที่ได้จาก คะแนนเฉลี่ยต่อลูกไก่ 1 ตัว จากการบันทึกเป็นระยะเวลานาน 8 วัน 6 ) เชื้อไวรัสที่มีความรุนแรงที่สุดจะมี ดัชนี สูงสุดที่ 2.0 (ห มายถึง ลูกไก่ทุกตัวตายภายใน 24 ชั่วโมง) และจะมี ดัชนี ต่าสุดที่ใกล้ 0.0 ในเชื้อไวรัสสายพันธุ์ lentogenic และสายพันธุ์ subclinical โดยเชื้อไวรัสที่พิจารณาแล้วว่ามีความรุนแรงจะมี ดัชนี ที่ไม่น้อยกว่า 0. 7 3.2. 4 วิธีจาแนกความก่อโรคโดยใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุล ( mole cular basis for pathogenicity ) เชื้อ APMV - 1 ส่วนใหญ่ ที่ ทาให้เกิดโรคในไก่ มี ลาดับกรด แอ มิโน ที่ 112 R/K - R - Q/K/R - K/R - R 116 ที่ตำแหน่ง C - terminus ของโปรตีน F 2 และ กรดแอมิโน F ( phenylalanine ) ที่ residue 117 ตาแหน่ง N - terminus ของโปรตีน F1 ส่วนเชื้อไวรัสสายพันธุ์รุ นแรงต่า มี ลาดับกรด แอ มิโน ที่ 112 G/E - K/R - Q - G/E - R 116 และ กรดแอมิ โน L ( leucine ) ที่ residue 117 น อกจากนี้ เชื้อ P PMV - 1 บาง สายพันธุ์ ที่แยกได้จากนกพิราบมี ลาดับกรด แอ มิโน ที่ 112 G - R - Q/K - K - R - F 117 แต่พบว่ามีค่า ICPI สูง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าหากมี basic amino acid อย่างน้ อย 1 คู่ ที่ residues 116 และ 115 ร่วมกับ กรดแอมิโน phenylalanine ที่ residue 117 และ basic amino acid (R) ที่ 113 เชื้อไวรัส สายพันธุ์ นี้ ก็จะ เป็นเชื้อ ไวรัส ที่ก่อ ความรุนแรงในไก่ ได้ 3.2.5 วิธี reverse transcription - polymerase chain reaction (RT - PCR) วิธี RT - PCR เป็นวิธีการตรวจยืนยันการติดเชื้อไวรัสโดยตรงที่ได้รับความนิยมมากที่สุด เนื่องจากเป็นวิธีที่ไม่ซับซ้อน และมีความไวสูง โดยการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัส โดยใช้ไพรเมอร์ ( primer) ที่จำเพาะ เพื่อให้ได้ปริมาณมากเพียงพอในการตรวจสอบด้วย วิธีอิเล็กโทรโฟ รีซิสต่อไป ขั้นตอนการตรวจเริ่มจากการสกัดสารพันธุกรรม หรืออาร์เอ็นเอของเชื้อไวรัส จากนั้นนาไปผ่าน กระบวนการสร้างดีเอ็นเอคู่สมด้วยปฏิกิริยารีเวอร์สทรานสคริปชั่น ( reverse transcription) แล้วทาการเพิ่มจานวนสารพันธุกรรมด้วยปฏิกิริยา PCR ต่อไป รายละเอียด ที่อธิบำยสาระสาคัญของการชันสูตรด้วยวิธี RT - PCR นี้ เป็นเพียงตัวอย่างเพื่อนาไปใช้ ทำความเข้าใจ อาจใช้วิธี RT - PCR อื่น ซึ่งใช้ ไพรเมอร์ เวลา อุณหภูมิ สารเคมี และเครื่องมือ ที่แตกต่าง จากที่ระบุได้ หากได้ทดสอบแล้วว่ามีความไวและความจาเพาะของวิธีการชันสูตร เทียบเท่าหรือดี กว่า และได้รับการเผยแพร่ในวารสารทางวิชาการ นานาชาติ วิธีที่ 1 เป็นวิธี RT - PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่อยู่บนตาแหน่ง ยีน F ( fusion) มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) สกัดอาร์เอ็นเอของเชื้อไวรัสจากตัวอย่าง โดยใช้ชุดสกัดอาร์เอ็นเอสาเร็จรูป และตั้งสารละลาย ที่สกัดได้ไว้บนน้าแข็งตลอ ดการทดสอบ เพื่อป้องกันการเสื่อม สภาพ ของอาร์เอ็นเอ 2 ) สร้างดีเอ็นเอคู่สม ด้วยชุดปฏิกิริยารีเวอร์สทรานสคริปชั่นจากตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ 3 ) เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอเป้าหมายแบบทวีคูณโดยใช้ไพรเมอร์ f orward primer และ r everse primer

มกษ. 10304 - 256 6 9 ตารางที่ 1 ลำดับนิวคลีโอไท ด์ของไพรเมอร์ที่ใช้ในมาตรฐานฉบับนี้ ไพรเมอร์ ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ 5 ’ - 3 ’ ขนาด คู่เบส ( base pair; bp ) ของผลิตภัณฑ์ เอกสารอ้างอิง forward primer GGT GAG TCT ATC CGG ARG ATA CAA G 202 Creelan et al., 2002 reverse primer TCA TTG GTT GCR GCA ATG CTC T 4 ) เตรียมสารเคมีส่วนผสมหลัก ( master mix) และแบ่งใส่หลอดปฏิกิริยาตามจานวนตัวอย่าง ที่ต้องการทดสอบ 5 ) เติม RT product ที่เป็นดีเอ็นเอคู่สม ผสมให้เข้ากัน 6) ปั่น เหวี่ยง สารทั้งหมดให้ตกลงก้นหลอด 7) นำตัวอย่างเข้า เครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดทดลอง ( thermocycler ) โดยตั้งสภาวะในขั้นตอนต่างๆ ดังนี้ ปฏิกิริยา อุณหภูมิ เวลา จานวนรอบ denaturation 95 o C 2 นาที 1 denaturation annealing extension 95 o C 48 o C 72 o C 15 วินาที 30 วินาที 30 วินาที 40 final extension 72 o C 12 นาที 1 หมายเหตุ ก) denaturati on หมายถึง การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน ข) annealing หมายถึง การจับของไพรเมอร์กับดีเอ็นเอแม่แบบ ค) extension หมายถึง การสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ ง) final extension หมายถึง การสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจากไพรเมอร์รอบสุดท้าย 8 ) การ อ่านและแปลผล ตรวจสอบผลด้วยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซิส โดยใช้อะกาโรสเจล ( agarose gel) 1.5 % ที่ละลายใน TBE (Tris - Borate - EDTA) และเปรียบเทียบแถบเรืองแสงที่เกิดจากแถบดีเอ็นเอของ ผลิตภัณฑ์ ( product band) กับเครื่องหมายดีเอ็นเอ ( DNA marker) และตัวอย่างควบคุม ผลบวก เพื่ออ่านผล ดังนี้ ก) ผลบวก หมายถึง พบ แถบดีเอ็นเอของผลิตภัณฑ์ 202 bp ข) ผลลบ หมายถึง ไม่พบหรือไม่มี แถบดีเอ็นเอของผลิตภัณฑ์ 202 bp

มกษ. 10304 - 256 6 10 วิธีที่ 2 เป็นวิธี RT - PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่อยู่บนตาแหน่ง ยีน M (matrix) มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) สกัดอาร์เอ็นเอของเชื้อไวรัสจากตัวอย่าง โดยใช้ชุดสกัดอาร์เอ็นเอสาเร็จรูป และตั้งสารละลาย ที่สกัดได้ไว้บนน้าแข็งตลอดการทดสอบ เพื่อป้องกันการเสื่อม สภาพ ของอาร์เอ็นเอ 2 ) สร้างดีเอ็นเอคู่สม ด้วยชุดปฏิกิริยารีเวอร์สทรานสคริปชั่นจากตัวอย่างอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ 3 ) เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอเป้าหมายแบบทวีคูณโดยใช้ไพรเมอร์ forward primer และ reverse primer ตารางที่ 2 ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ที่ใช้ในมาตรฐานฉบับนี้ ไพรเมอร์ ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ 5 ’ - 3 ’ ขนาดคู่เบส ( base pair; bp ) ของผลิตภัณฑ์ เอกสารอ้างอิง forward p rimer AGT GAT GTG CTC GGA CCT TC 121 Wise et al., 2004 reverse primer CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA 4 ) เตรียมสารเคมีส่วนผสมหลัก ( master mix) และแบ่งใส่หลอดปฏิกิริยาตามจานวนตัวอย่าง ที่ต้องการทดสอบ 5) เติม RT product ที่เป็นดีเอ็นเอคู่สม ผสมให้เข้ากัน 6 ) ปั่น เหวี่ยง สารทั้งหมดให้ตกลงก้นหลอด 7) นำตัวอย่างเข้าเครื่องเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมในหลอดทดลอง ( thermocycler ) โดยตั้งสภาวะในขั้นตอนต่างๆ ดังนี้ ปฏิกิริยา อุณหภูมิ เวลา จานวนรอบ denaturation 94 o C 2 นาที 1 denaturation annealing extension 94 o C 55 o C 68 o C 15 วินาที 30 วินาที 60 วินาที 40 final extension 68 o C 5 นาที 1 8) การ อ่านและแปลผล ตรวจสอบผลด้วยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซิส โดยใช้อะกาโรสเจล ( agarose gel) 1.5% ที่ละลาย ใน TBE (Tris - Borate - EDTA) และเปรียบเทียบแถบเรืองแสงที่เกิดจากแถบดีเอ็นเอ ของ ผลิตภั ณฑ์ ( product band) กับเครื่องหมายดีเอ็นเอ ( DNA marker) และตัวอย่างควบคุม ผลบวก เพื่ออ่านผล ดังนี้ ก) ผลบวก หมายถึง พบ แถบดีเอ็นเอของผลิตภัณฑ์ 121 bp ข) ผลลบ หมายถึง ไม่พบหรือไม่มี แถบดีเอ็นเอของผลิตภัณฑ์ 121 bp

มกษ. 10304 - 256 6 11 3.2. 6 วิธี real - time RT - PCR วิธี real - time RT - PCR เป็นวิธีการที่ใช้ตรวจหาปริมาณสารพันธุกรรม โดยอาศัยตัวติดตาม หรือ probe ที่ติดสารเรืองแสง ( fluorogenic hydrolysis probe) หรือ สารย้อมสีเรืองแสง ( fluorescent dye ) เป็นตัววัดปริมาณสารพันธุกรรมที่ได้จากการทำปฏิกิริยา โดยไม่ต้อง มีขั้นตอนการตรวจหาลำดับสา รพันธุกรรมเพื่อยืนยันความจำเพาะของแถบดีเอ็นเอ และสามารถทราบผลการตรวจได้ อย่างรวดเร็ว รายละเอียด ที่อธิบายสาระสาคัญของการชันสูตรด้วยวิธี real - time RT - PCR นี้ เป็นเพียงตัวอย่าง เพื่อนำไปใช้ทำความเข้าใจ อาจใช้วิธี real - time RT - PCR อื่น ซึ่งใช้ ไพรเมอร์ เวลา อุ ณหภูมิ สารเคมี และเครื่องมือที่แตกต่างจากที่ระบุได้ หากได้ทดสอบแล้วว่ามีความไวและความจาเพาะ ของวิธีการชันสูตรเทียบเท่าหรือดีกว่า และได้รับการเผยแพร่ในวารสารทางวิชาการ นานาชาติ วิธี real - time RT - PCR มีขั้นตอน ดังนี้ 3.2.6.1 การเตรียม 10 % suspension จากตัวอ ย่างอวัยวะ : 1 ) ตัด ตัวอย่างอวัยวะ หนักประมาณ 1 g เป็นชิ้นเล็กๆ ด้วยกรรไกรสะอาดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ ด้วยความร้อน 2) ใส่ตัวอย่างในโกร่งบดปลอดเชื้อ และ บดให้ละเอียด 3) นำตัวอย่างที่บดมาทำเป็น suspension เจือจาง 1 0% ( w/v) โดยเติมสารละลาย PBS ปริมาตร 9 ml ผสมให้เ ข้ากัน แบ่ง suspension ที่ได้ใส่ หลอด ไมโคร เซนติฟิว ขนาด 1.5 ml 4) ปั่นเหวี่ยง suspension ที่ความ เร่ง 1 , 000 g เป็นเวลา 10 นาที หรือ 2 , 500 g เป็นเวลา 5 นาที 5) เก็บส่วนใส และ แยกใส่ใน หลอดไมโครเซนติฟิว ใหม่ 6 ) นา สารละลายที่ได้ไปทาการทดสอบใน ขั้ นตอนการสกัดสารพัน ธุกรรมของเชื้อไวรัสต่อไป หรือเก็บที่ - 2 0 ◦ C เพื่อรอการทดสอบ หรือเก็บที่ - 8 0 ◦ C เพื่อเก็บรักษาเชื้อไวรัสในระยะยาว 3.2.6.2 การเตรียม ตัวอย่างป้ายเชื้อจากช่องทวารร่ วม และ จากคอหอยส่วนปาก : 1 ) นาหลอดตัวอย่างไปเขย่า โดยใช้ vortex mixer เป็นเวลา 15 วินาที และ แยกเอาก้ำนสาลี ออก ทิ้งในถังขยะติดเชื้อ 2 ) แบ่ง ตัวอย่างที่ได้ใส่ใน หลอดไมโครเซนติฟิว ขนาด 1.5 ml จานวน 2 หลอด ใช้หนึ่งหลอด สาหรับทาการทดสอบ และอีกหนึ่งหลอดสาหรับเป็น stock เก็บไว้ที่ - 80 ◦ C 3 ) ปั่นเหวี่ยงสารละลายที่ความ เร่ง 1 , 000 g เป็นเวลา 10 นาที หรือ 2 , 500 g เป็น เวลา 5 นาที 4 ) เก็บส่วนใสและ แยกใส่ใน หลอดไมโครเซนติฟิว ใหม่ 5 ) นำของเหลวที่ได้ไปทาการทดสอบใน ขั้ นตอนการสกัดสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัสต่อไป หรือเก็บที่ - 2 0 ◦ C เพื่อรอการทดสอบ หรือเก็บที่ - 8 0 ◦ C เพื่อเก็บรักษาเชื้อไวรัสในระยะยาว 3.2.6.3 การสกัดสารพันธุกรรมของเชื้ อไวรัส : การสกัดสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัสทุกครั้งจะต้อง เตรียม ตัวอย่างควบคุม ผล ล บ ที่ได้จาก การสกัดตัวอย่าง (negative control extraction ; NCE) และตัวอย่างควบคุม ผล บวก อ่อน ที่ได้ จากการสกัดตัวอย่าง ( weak positive control extraction) ควบคู่ ไปด้วยอย่างละ 1 ตัวอย่ำง

มกษ. 10304 - 256 6 12 เพื่อเป็นการควบคุมการปนเปื้อนและค วบคุมวิธีการสกัด ตามลาดับ โดย ขั้ น ตอนการปฏิบัติงาน ให้ปฏิบัติตามการ สกัดสารพันธุกรรมชนิด อาร์เอ็นเอ ของเชื้อไวรัส โดยใช้ ชุดสกัดสาเร็จรูป 3.2.6.4 การเตรียม สารละลาย ไพรเมอร์ และ p robe mix : ไพรเมอร์ และ p robe สาหรับตรวจหาเชื้อ A PMV - 1 จะอยู่ในรูปของสารละลายที่มีความเข้มข้น เริ่มต้น 100 μM และเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ - 20 ◦ C หรือต่ากว่า เมื่อต้องการนำมาใช้ จะ มีการ เตรียมให้อยู่ในรูปของสารละลาย ไพรเมอร์ และ probe mix ที่มีความเข้มข้นสาหรับนามาใช้ ( working solution concentration) โดยละลายใ น double - distilled water (ddH 2 O) ซึ่งสาร ละลาย เหล่านี้ หากใช้ ไม่หมดต้อง เก็บรักษาที่อุณหภูมิ - 20 ◦ C หรือต่ากว่า ตารางที่ 3 ไพรเมอร์และ probe สา หรับตรวจหาเชื้อ APMV - 1 ชนิด ชื่อ ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ 5 ’ - 3 ’ p robe label ( 5’ - 3’ ) forward primer M+ 4100 AGT G AT GTG CTC GGA CCT TC reverse primer M - 4220 CCT GAG GAG AGG CAT TTG CTA p robe M+ 4169 TTC TCT AGC AGT GGG ACA GCC TGC FAM – BHQ 1 3.2.6.5 การเตรียม m aster mix : ให้ใช้ ชุดน้ายาสาหรับเตรียม m aster mix สาเร็จรูปตามคาแนะนาของผู้ผลิต 3.2.6.6 การเพิ่มปริมาณสำรพันธุกรรมโดยวิธี real - time RT - PCR : 1 ) การทา real - time RT - PCR ในทุก ๆ การทดสอบสาหรับตรวจหาสารพันธุกรรมของเชื้อไวรัส จะต้องมีตัวอย่างควบคุม ที่ ทดสอบควบคู่กันไปด้วย ได้แก่ ตัวอย่างควบคุม ผล ลบ ( no template control; NTC) เช่น ตัวอย่างที่เตรียมจาก ddH 2 O สาหรับควบ คุมการปนเปื้อน และตัวอย่าง ควบคุม ผล บวก อ่อน ( weak positive control) สาหรับควบคุมวิธี real - time RT - PCR โดยจะ มี การ เตรียมจากกรดนิว คลิ อิกของเชื้อ APMV - 1 ซึ่งอาจอยู่ในรูป RNA extracts หรือ cDNA หรือ recombinant DNA ก็ได้ 2 ) การใช้งานเครื่อง real - time RT - PCR ให้ป ฏิบัติ ตามคาแนะนาของผู้ผลิต ดังนี้ ขั้นตอน อุณหภูมิ เวลา จานวนรอบ reverse transcription 45 o C 10 นาที 1 RT inactive/ initial denaturation 95 o C 10 นาที 1 amplification 95 o C 15 วิ นาที 45 60 o C 45 วิ นาที

มกษ. 10304 - 256 6 13 3.2.6.7 การ อ่านผล : 1 ) ตัวอย่างควบคุม ผล บวก ก) ต้องปรา กฏ เส้นโค้งที่มีลักษณะจาเพาะ (amplification curve ) เป็นรูปร่าง S curve จาก การเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรม บน จอแสดงผล และปราก ฏ ค่า c ycle threshold ( Ct ) ของตัวอย่างควบคุม ผล บวกในขั้นตอน real - time RT - PCR รวมทั้งตัวอย่างควบคุม ผล บวกในขั้นตอนการสกัด สารพันธุกร รม ข) ค่า Ct ของตัวอย่างควบคุม ผล บวกต้องอยู่ในช่วงที่ยอมรับได้ 2 ) ตัวอย่างควบคุม ผล ลบ ( NTC และ NCE) ต้องไม่ปรากฏเส้นโค้งที่มีลักษณะจาเพาะของการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เพื่อยืนยันว่า ไม่เกิดการปนเปื้อนใด ๆ ตลอดกระบวนการ 3 ) ตัวอย่างทดสอบ อ่านผลการทดสอบ เมื่ อปรากฏเส้นโค้งที่มีลักษณะจาเพาะ จาก การเพิ่มปริมาณ สารพันธุกรรม อยู่เหนือกว่าเกณฑ์ที่กาหนดและการทดสอบ มีความ ถูกต้อง แล้ว นา ผลการ ทดสอบ ไปวิเคราะห์ ต่อไป 3.2.6.8 การ แปลผล 1 ) ผลบวก ก) ปรากฏ เส้นโค้งที่มีลักษณะจาเพาะ จาก การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเช่นเดียวกับตัวอย่าง ควบคุม ผล บวก ข) ค่า Ct ของเชื้อ APMV - 1 น้อยกว่า 36 (จาก 45 รอบปฏิกิริยา) 2 ) ผลลบ ก) ไม่ปรากฏ เส้นโค้งที่มีลักษณะจำเพาะ จาก การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเช่นเดียวกับ ตัวอย่างควบคุม ผล บวก ข) ไม่สามารถตรวจสอบค่า Ct ได้ หรือค่า Ct มากกว่า 40 (จาก 45 รอบปฏิกิริยา) 3 ) ผลไม่แน่ชัด ก) ค่า Ct อยู่ในช่วง 36 - 40 ข) ในกรณีนี้ต้องทำการทดสอบ ซ้า หรือทดสอบด้วยวิธีอื่น เนื่องจาก อาจเกิดการปนเปื้อน ขณะปฏิบัติงาน ตัวอย่างสารพันธุกรรมอาจมีปริมาณไม่เพียงพอ อาจเกิดการยับยั้งกำรทางาน เนื่องจากตัวยับยั้งต่าง ๆ หรือปริมาณ เชื้อ ไวรัสที่นามำสกัดสารพันธุกรรมอาจมีปริมาณต่าเกินไป ทั้งนี้ การแปลผลของค่า Ct ขึ้นอยู่กับอุปกรณ์และน้ายาเคมีที่ใช้ทดสอบ 3.2. 7 วิธี การหาลำดับยีน ( gene sequencing ) วิธี การหาลำดับยีน เป็นการหาลำดับเบสของนิวคลีโอไทด์ โดยใช้ความแตกต่างของ ยีน วิธีนี้เป็นประโยชน์อย่างมากในกา รใช้จาแนกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ของเชื้อไวรัส และจาแนกชนิดของจีโนไทป์ วิธีการตรวจจะใช้ ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากวิธี PCR นาไปหาลาดับเบส แล้ว

มกษ. 10304 - 256 6 14 นำลำดับเบสที่ได้มา วิเคราะห์ด้วยโปรแกรมคอมพิวเตอร์ โดยเปรียบเทียบกับเชื้อไวรัส ในฐานข้อมูล เช่น GenBank ทำให้สามารถจำแนกจี โนไทป์ ความรุนแรงของเชื้อ ไวรัส และการกลายพันธุ์ของเชื้อไวรัสได้ 3.2. 8 วิธีการยับยั้งการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง ( haemagglutination inhibition; HI) วิธี HI เป็ น การต รวจหำแอน ติบ อดี ใน ซีรัม ที่ป้ องกัน ไม่ ให้ โป รตี น ฮี แม กกลูติ นิ น ( haemagglutinin) บนผิวของเชื้อไวรั สจับกับตัวรับบนผิวของเม็ดเลือดแดง และทำให้ ไม่เกิดปฏิกิริยาการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง การตรวจด้วยวิธีนี้มีข้อดี คือ สามารถตรวจ ในขณะที่ สัตว์ปีก มีชีวิตและสะดวกในการเก็บตัวอย่างซีรัม รวมทั้งสามารถทำได้ง่าย ในห้องปฏิบัติการทั่วไป แต่ ควร เก็บซีรัมคู่ ( paired sera) สาหรับเปรียบเทียบ ห่างกัน 10 - 21 วัน เพื่อดูการเพิ่มขึ้นของระดับแอนติบอดี วิธีการเตรียมแอนติเจนของเชื้อไวรัส มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) ฉีดเชื้อ APMV - 1 ( l entogenic strain ) ปริมาตร 0.1 - 0.2 ml เข้าทาง a llantoic cavity ของไข่ไก่ฟัก อายุ 9 - 11 วัน 2 ) บ่ม ไข่ไก่ ฟั กที่อุณหภูมิ 37 ◦ C 3 ) หลังฉีดเชื้อ 48 - 72 ชั่วโมง นาไข่ที่ฉีดเชื้อ แช่เย็น ที่อุณหภูมิ 4◦ C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง 4) ดูดเก็บ allantoic fluid จากไข่ไก่ฟัก ระวังอย่าให้มีไข่แดง หรือไข่ขาวปน 5) ปั่ นเหวี่ยงที่ ความเร่ง 1,000 g เป็นเวลา 10 นาที 6) อาจทาให้เชื้อไวรั สหมดฤทธิ์ด้วยวิธีการที่เหมาะสม เช่น เติม ฟอร์มาลิน หรือ เบตา - โพรพิโอ แลกโตน ( beta - propiolactone) 7) แ บ่งบรรจุในหลอดขนาดเล็ก แล้วเก็บที่อุณหภูมิ - 20 ◦ C หรือ - 80 ◦ C วิธีการเตรียมเม็ดเลือดแดงไก่ มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) เจาะเลือดไก่ ที่ปลอดจากแอน ติบ อดีเฉพำะต่อเชื้อ AP MV - 1 อย่างน้อย 3 ตัว ใส่ในสารละลายอัลซีเวอร์ ( Alsever ’ s solution) ในอัตราส่วน 1:1 2 ) ล้ำงเม็ดเลือดแดง 3 ครั้ง ด้ วย สารละลาย isotonic PBS (0.01 M) โดยการปั่ นเหวี่ยง ที่ ความเร่ง 800 g เป็นเวลา 5 นาที และปรับสารละลายให้มี pH 7.0 - 7. 2 3 ) ปรับความเข้ มข้ นของเม็ ดเลือดแดง ที่เตรียมไว้ไม่นาน เกิน 1 สัปดาห์ ให้ มีความเข้ มข้ น 1 % ( v/v ) ใน สารละลาย PBS วิธี HI มีขั้นตอน ดังนี้ 1 ) เจือจางแอนติเจนของเชื้อไวรัส ซึ่งเตรียมจากการฉีดเชื้อไวรัสเข้าในไข่ไก่ฟัก ให้มีความเข้มข้น 4 HAU/ 0.025 ml และต้องทา back titration เพื่อตรวจยื นยันความเข้มข้นของแอนติเจน 2 ) ใส่สารละลาย PBS ปริมาตร 0.0 25 ml ลงในเพลต ( microtitre plate) ที่มีก้นหลุม เป็นรูปตัววี ( V) หรือตัวยู ( U )

มกษ. 10304 - 256 6 15 3 ) เติมซีรัม ปริมาตร 0 .025 ml ลงในหลุมแรกของเพลต 4 ) เจือจางซีรัมเชิงอนุกรม 2 เท่า ( two - fold dilutions) ด้วยปริมาตร 0 .025 ml ทุกหลุม ยกเว้นหลุมสุดท้าย ซึ่งเป็นหลุมควบคุมเม็ดเลือดแดง 5 ) เติม 4 HAU ของแอนติเจนของเชื้อไวรัส ปริมาตร 0 .025 ml ในทุกหลุมแล้วทิ้งไว้ เป็นเวลา 30 นาที ที่อุณหภูมิ ห้อง หรือ เป็นเวลา 60 นาที ที่อุณหภูมิ 4 ◦ C 6 ) เติมเม็ดเลือดแดงไก่ 1 % ( v/v) ปริมาตร 0 . 025 ml ลงในทุกหลุมแล้วเคาะเพลตเบาๆ ให้ผสมเข้ากัน ตั้งทิ้งไว้ เป็นเวลา 40 นาที ที่อุณหภูมิ ห้อง หรือ เป็นเวลา 60 นาที ที่อุณหภูมิ 4 ◦ C พบว่าเม็ดเลือดแดงในหลุมควบคุมจะรวมตัวกันที่ก้นหลุม และมีลักษณะคล้ายเม็ดกระดุม 7 ) พิจารณาระดับไตเตอร์ได้จากความ เจือจาง สูงสุด ของซีรัม ที่เกิดการยับยั้งการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดงอย่างสมบูรณ์ ของ 4 HAU ของแอนติเจนของเชื้อไวรัส และ ประเมินการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดงจากการเอียงเพลต โดยเมื่อเอียงเพลตแล้วพบว่ามีการไหลของเม็ดเลือดแดง เท่ากับการไหลของเม็ดเลือดแดงในหลุมควบคุมผลบวก (ที่เติม เม็ดเลือดแดง ปริมาตร 0 .025 ml และสารละลาย PBS ปริมาตร 0 .05 ml) แสดงว่ามีการยับยั้งการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง โดยพบว่าเม็ดเลือดแดงจะรวมตัวกันที่ก้นหลุม และมีลักษณะคล้ายเม็ดกระดุม 8 ) ความใช้ได้ของผลการทดสอบ ควรประเมินจากตัวอย่างซีรัมควบคุมผลลบ ซึ่งควรมีระดั บ ไตเตอร์ น้อยกว่า หรือเท่ากับ 4 หรือ 2 2 และตัวอย่างซีรัมควบคุมผลบวก ควรมีระดับไตเตอร์ อยู่ ระหว่าง ± 1 log ของซีรัมที่ทราบระดับไตเตอร์ 9 ) การ อ่านและแปลผล ตัวอย่างที่ให้ผลบวก จะพบระดับไตเตอร์เท่ากับ หรือมากกว่า 16 หรือ 2 4 แสดงว่ามีแอนติบอดี ต่อเชื้อ APMV - 1 สาหรับ ห้องปฏิบัติการ ที่ใช้ แอนติเจนของเชื้อไวรัส เข้มข้น 8 HAU ในกรณีนี้ ตัวอย่างที่ให้ผลบวก จะพบระดับไตเตอร์เท่ากับ หรือมากกว่า 8 หรือ 2 3 แสดงว่ามีแอนติบอดีต่อเชื้อ APMV - 1 3.2. 9 วิธี enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA) วิธี ELISA เป็นวิธีการตรวจ การตอบสนองทาง ภูมิคุ้มกันที่มีความเหมาะสม โดยสามารถ ตรวจหาระดับ ของแอนติบอดี ทั้งจากการให้วัคซีนและการติดเชื้อโดยธรรมชาติได้ นอกจากนี้ ยังสามารถตรวจหาระดับ ของแอนติบอดี ต่อเชื้อไวรัสได้ในทุก ซีโรไทป์ การทดสอบด้วยวิธี ELISA สามารถใช้ชุดทดสอบสาเร็จรูปที่พัฒนาโดยผู้ผลิตชุดทดสอ บ และทดสอบตามคาแนะนาของผู้ผลิต

มกษ. 10304 - 256 6 16 ภาคผนวก ก (ให้ไว้เป็นข้อมูล) วิทยาการระบาด อาการ และพยาธิวิทยาของโรคนิวคาสเซิล ก. 1 วิทยาการระบาด โรคนิวคาสเซิล มีสาเหตุเกิดจากเชื้อ avian paramyxovirus type 1 ( APMV - 1 ) สายพันธุ์ รุนแรง ในสกุล Orthoavulavirus วงศ์ย่อย Avul avirinae และวงศ์ Paramyxoviridae โดยเชื้อ paramyxovirus ที่แยกได้จากสัตว์ปีก สามารถจำแนก ได้ จาก การ ทดสอบ ทาง ซีรัม วิทยา และ การวิเคราะห์ ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม ( phylogenetic analysis ) ออกเป็น 21 ซีโรไทป์ ( serotype ) ของ avian paramyxovirus คือ APMV - 1 ถึง APMV - 2 1 โรคนิวคาสเซิลพบ รายงาน ครั้งแรกในปี พ.ศ. 2469 และเป็นโรคประจำถิ่น ( endemic ) ในหลายประเทศ ซึ่ง มีการ ให้ วัคซีนป้องกันโรคใน สัตว์ปีก โดย โรคนิวคาสเซิลอยู่ในบัญชีรายชื่อ โรคระบาดสัตว์บกของ องค์การสุขภาพสัตว์โลก และเป็นโรค ระบาด ตามพระราชบัญญัติ โรคระบาดสัตว์ พ.ศ. 2 558 สายพันธุ์ของ เชื้อ APMV - 11 แบ่ง ตาม ความรุนแรง ออกได้เป็น 5 ชนิดการก่อโรค ( pathotype ) ดังนี้ ก. 1 .1 v iscerotropic velogenic APMV - 1 เป็ น สายพั น ธุ์ ที่ มี การ เกิ ด โรค อ ย่างรุน แ รง โดยมักพบ รอยโรคเลือดออกที่ ผนัง ลาไส้ ก . 1.2 n eurotropic velogenic APMV - 1 เป็ น สำย พั น ธุ์ ที่ ทำให้ เกิ ด อั ต รำกำรตำย สู ง โดย ปกติ พบอาการทางระบบทางเดินหายใจและอาการทางระบบประสาท ก. 1.3 m esogenic APMV - 1 เป็นสายพันธุ์ที่ ทำให้เกิดอาการทางระบบทางเดินหายใจ โดยอาจพบอาการทางระบบประสาท แต่มีอัตราการตายต่า ก. 1.4 l entogenic APMV - 1 หรือ respiratory APMV - 1 เป็ นสายพันธุ์ที่ทาให้ เกิดการติดเชื้อ ของ ระบบทางเดินหายใจแบบอ่อนหรือ แบบ ไม่แสดงอาการ ก. 1.5 s ubclinical APMV - 1 เป็นสายพันธุ์ ที่ ปกติ ทำให้เกิดการติดเชื้อใน ทางเดินอาหาร แบบไม่แสดงอาการ อำจพบการติดเชื้อ APMV - 1 ในคน โดยส่วนใหญ่พบอาการเยื่อตาอักเสบ ( conjunctivitis ) ภายใน 24 ชั่วโมงหลังการสัมผัสเชื้อ APMV - 1 สายพันธุ์รุนแรง การติดเชื้อไม่ได้ก่อให้เกิด อันตรายต่อชีวิต โดยทั่วไป ทาให้ร่างกายอ่อนแอไม่เกิน 1 - 2 วัน อาการทางคลินิกที่ ชัดเจน และ พบมาก ในการติดเชื้อในคน คือ การติดเชื้อที่ตา โดย ปกติ จะพบอาการตาแดงข้างเดียว หรือ ทั้ง 2 ข้าง มีน้าตาไหล เปลือกตา บวม เยื่อตา อักเสบ และมี เลือดออกในชั้น ใต้เยื่อตา

มกษ. 10304 - 256 6 17 ถึงแม้ว่าผลกระทบต่อตาอาจมีความรุนแรงค่อนข้างมาก แต่การติดเชื้อส่วนใหญ่เป็นแบบชั่วคราว และ ไม่มีผลกระทบต่อ กระจกตา ในปัจจุบันยังไม่พบ หลักฐานการแพร่เชื้อ ระหว่างคนสู่คน อย่างไรก็ตาม พบรา ยงาน การแยกเชื้อ APMV - 1 แวเรียนท์ ที่พบ ในนกพิราบ (PPMV - 1 ) จากผู้ป่วยภูมิคุ้มกันบกพร่อง ซึ่ง เสียชีวิตจาก ปอดบวม ก. 2 อาการ อาการของโรคแตกต่างกันไปตามชนิดของสัตว์ปีก ก. 2.1 ไก่ อาการที่พบในไก่ ได้แก่ 1 ) อาการทั่วไป กินอาหารลดลง ซึม ผอมแห้ง มีการบวมน้าที่หน้ำ (โดยเฉพาะที่เนื้อเยื่อรอบๆ ตา) มีรอยห้อเลือด ที่ผิวหนัง บางแห่งอาจเป็นจุดเลือดออก (โดยเฉพาะที่หงอน) หรือมีรอยช้าเลือดและบวมที่เหนียง และหงอน กรณีที่การระบาดเกิดจากเชื้อ ไวรัส สายพันธุ์รุนแรง ไก่จะตายแบบเฉียบพลัน โดยไม่แสดง อาการป่วย 2 ) อาการของระบบสืบพันธุ์ การให้ไข่น้อยลง ขนาดไข่เล็กลง ลักษณะไข่ผิดปกติ เปลือกไข่ขรุขระ หรือไม่มีเปลือก ไข่ขาว มีคุณภาพต่า 3 ) อาการของระบบทางเดินหายใจ มีเสียงหายใจครืดคราด ไอ จาม มีน้ามูก อ้าปากหายใจ หายใจลาบาก 4 ) อาการของระบบทางเดินอาหาร ท้องเสีย ถ่าย เหลว มี สีเขียวเหลือง 5 ) อาการของระบบประสาท มีหลากหลาย ได้แก่ หัวสั่น ตัวสั่น กล้ามเนื้อกระตุก คอบิด ชัก ปีกและขาเป็น อัมพาต ก. 2.2 ไก่งวง : 1 ) อาการเด่นชัด ได้แก่ อาการของระบบทางเดินหายใจและระบบประสาท อาจพบ การให้ ไข่ น้อยลง ลักษณะไข่ผิดปกติ เปลือกไข่นิ่ม ไข่ขาวมีคุณภาพต่า 2 ) กา รระบาดของเชื้อไวรัสบางครั้ง ไก่งวงอาจไม่แสดงอาการใดๆ นอกจาก ปีกและขาเป็น อัมพาต บางส่วนหรือทั้งหมด 3 ) การระบาดของเชื้อไวรัส สายพันธุ์รุนแรง ทาให้ไก่งวงตายแบบเฉียบพลันเป็นจานวนมาก ก. 2.3 เป็ดและห่าน : เป็ดและห่านมีความทนทานต่อ เชื้อ APMV - 1 โดยไม่แสดงอาการป่วยใดๆ หลังจากได้รับ เชื้อไวรัส อย่างไรก็ตาม เคยมีรายงานของโรคในเป็ด ห่าน และหงส์ โดยมีอัตราการป่วยไม่เกิน 10 % อัตราการตายในเป็ดและห่านไม่เกิน 10 % ส่วนในหงส์ไม่มีการตาย

มกษ. 10304 - 256 6 18 ก. 2.4 นกพิราบ : 1 ) เชื้อไวรัสที่พบในนกพิราบมีทั้งชนิด ที่พบทั่วไป ได้แก่ เชื้อ APMV - 1 และ เชื้ อ APMV - 1 แวเรียนท์ ( PPMV - 1 ) โดยอัตราการป่วยและ อัตราการตายขึ้นอยู่กับความรุนแรงของเชื้อไวรัส 2 ) โดยทั่วไปนกพิราบจะแสดงอาการของระบบทางเดินอาหารก่อน โดยมีอาการท้องเสีย ถ่าย เหลวเป็นน้าหรือมีเลือดปน ตามด้วยอาการของระบบประสาท ได้แก่ หัวสั่น ตัวสั่น คอบิด ปีก และขาเป็น อัมพาตข้างเดียวหรือทั้ง 2 ข้าง เสียการทรงตัวและการมองเห็น มักไม่พบอาการ ของระบบทางเดินหายใจ 3 ) ในบางครั้งอาจพบเฉพาะอาการของระบบประสาท โดยไม่มีอาการของระบบทางเดินอาหาร หรือพบอาการของระบบทางเดินอาหาร โด ยไม่มีอาการของระบบประสาท ก. 2.5 นกป่าชนิดต่างๆ : อาการที่พบในนกป่ามีต่างๆ กันไป เช่น นกจาพวกนกยูง ไก่ฟ้า นกแก้ว มีความไวต่อการติด เชื้อไวรัส โดยมีอัตราการตายสูงมาก ส่วนนกพิราบ และ นกเขา มีความไวต่อการติดเชื้อไวรัส น้อยกว่า โดยส่วนใหญ่จะแสดงอาการทางระบบประสาท ก. 3 พยาธิ วิทยา ลักษณะทางพยาธิวิทยาของโรคนิวคาส เซิลมีความแตกต่างกันไปตามชนิดสายพันธุ์ของเชื้อไวรัส สำหรับรอยโรคจากการผ่าซาก ไม่มีลักษณะรอยโรคที่บ่งชี้โรคนิวคาสเซิลอย่างชัดเจน สัตว์ปีก ที่ตายแบบเฉียบพลันด้วยโรคนิวคาสเซิลอาจไม่พบรอยโรคใดๆ อย่างไรก็ตาม ลักษณะของรอยโรค ที่พบทั่วไป ได้แก่ ก. 3.1 ระบบทางเดิน อาหาร มีจุดเลือดออกและเนื้อตายที่เยื่อบุทางเดินอาหาร โดยเฉพาะส่วน กระเพาะแท้ ไส้ตัน และลาไส้เล็ก ก. 3.2 ระบบประสาท ไม่พบ เมื่อสังเกตด้วยตาเปล่า ก. 3.3 ระบบทางเดินหายใจ ถุงลมอักเสบ ท่อลมอักเสบ มีเมือกใส หนอง หรือมีเลือดออก ก. 3.4 ระบบสืบพันธุ์ ไข่นิ่มเหลว ไข่ แดงแตกในช่องท้อง อาจพบการอักเสบของรังไข่ ก. 3.5 ผิวหนังและตา หน้าบวม ตาบวม เยื่อตาอักเสบ ก. 3.6 อวัยวะภายในต่างๆ มีการอักเสบกระจายทั่วไปตามอวัยวะต่างๆ bursa of Fabricius อักเสบ มีจุดเลือดออก มีจุดเนื้อตายที่กล้ามเนื้อหัวใจ ตัวอย่างของ รอยโรคของการติดเชื้อ APMV - 1 ในสัตว์ปีก ให้ไว้เป็นข้อมูล ในภาคผนวก ข

มกษ. 10304 - 256 6 19 ภาคผนวก ข (ให้ไว้เป็นข้อมูล) รอยโรคของการติดเชื้อ APMV - 1 ในสัตว์ปีก ภาพที่ ข .1 มีจุดเลือดออกที่เยื่อบุทางเดินอาหาร ภาพที่ ข .2 เยื่อตาอักเสบ ภาพที่ ข . 3 ท่อลมอักเสบ มีเมือกใส และ หนอง ภาพที่ ข . 4 ท่อลม อักเสบ มีมูก และมีจุดเลือดออก ภาพที่ ข . 5 พบรอยโรคที่กระเพาะแท้ และ กระเพาะบด ได้แก่ มีเลือดออกที่กระเพาะแท้ (จุดที่ 1 ) เยื่อบุกระเพาะบดลอกหลุดง่าย (จุดที่ 2 ) และ ผนังกระเพาะบดมีเลือดออก (จุดที่ 3 ) 1 2 3 1

มกษ. 10304 - 256 6 20 ภาพที่ ข . 6 มี เลือดออกที่อวัยว ะภายในต่างๆ ได้แก่ ผนังช่องอก (จุดที่ 1 ) หัวใจ ไขมันที่ขั้วหัวใจ (จุดที่ 2 ) และไขมันด้านนอกของกระเพาะแท้ (จุดที่ 3 ) ภาพที่ ข . 7 พบรอยโรคที่หย่อมน้าเหลือง (gut associated lymphoid tissue; GALT ) ที่ผนังลำไส้ ได้แก่ เนื้อตาย (จุดที่ 1 , 3 และ 4 ) และ เลือดออก (จุดที่ 2 ) ภาพที่ ข . 8 ทอนซิลไส้ตันมีเลือดออก ภาพที่ ข . 9 เยื่อหุ้มไข่แดงเสื่อม ที่มา : ร ศ.นิวัตร จันทร์ศิริพรชัย คณะสัตวแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย (ภาพที่ ข . 1 - ข . 3 ) ศ. จิโรจ ศศิปรียจันทร์ คณะสัตวแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย (ภาพ ที่ ข . 4 - ข . 9 ) 1 2 3 1 2 3 4