ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ เรื่อง กำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพสำหรับปศุสัตว์ ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551

ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ เรื่อง กำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพสำหรับปศุสัตว์ ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551 ด้วยคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร เห็นสมควรกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร เรื่อง แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพสาหรับปศุสัตว์ เป็นมาตรฐานทั่วไป ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551 เพื่อส่งเสริมสินค้าเกษตรให้ได้คุณภาพ มาตรฐาน และปลอดภัย อาศัยอานาจตามความในมาตรา 5 มาตรา 15 วรรคสอง และมาตรา 16 แห่งพระราชบัญญัติ มาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. 2551 ประกอบมติคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร ในการประชุม ครั้งที่ 1/2566 เมื่อวันที่ 29 มีนาคม 2566 รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหก รณ์ จึงออกประกาศกาหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้าน จุลชีพสาหรับปศุสัตว์ มาตรฐานเลขที่ มกษ. 9065 - 2566 ไว้เป็นมาตรฐานทั่วไป ดังมีรายละเอียด แนบท้ายประกาศนี้ ทั้งนี้ ให้ใช้บังคับตั้งแต่วันถัดจากวันประกาศในราชกิจจานุเบกษำเป็นต้นไป ประกาศ ณ วันที่ 26 เมษายน พ.ศ. 25 6 6 ประภัตร โพธสุธน รัฐมนตรีช่วยว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ปฏิบัติราชการแทน รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ้ หนา 6 ่ เลม 140 ตอนพิเศษ 171 ง ราชกิจจานุเบกษา 14 กรกฎาคม 2566

มกษ . 9065-2566 ขอข้อคิดเห็นก่อนการสัมมนา มาตรฐานสินค้าเกษตร แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรีย ต่อยาต้านจุลชีพสําหรับปศุสัตว์ 1. ขอบข่าย มาตรฐานสินค้าเกษตรนี้ ให้แนวทางการทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพ (antimicrobial susceptibility testing; AST) ของแบคทีเรียที่แยกได้จากตัวอย่างในแต่ละขั้นตอนของโซ่การผลิตปศุสัตว์เพื่อการบริโภค เพื่อให้ห้องปฏิบัติการด้านการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพที่เกี่ยวข้องกับการเฝ้าระวัง และตรวจติดตามเชื้อดื้อยาในปศุสัตว์นําไปปรับใช้ให้มีความสอดคล้องเป็นมาตรฐานเดียวกัน ครอบคลุมข้อแนะนําสําหรับห้องปฏิบัติการในการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ การเลือกวิธีทดสอบ การเลือกยาต้านจุลชีพที่ใช้ในการทดสอบ ช่วงความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพ เกณฑ์การแปลผล ข้อแนะนําสําหรับการปฏิบัติงาน วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ การบันทึกและเก็บรักษาข้อมูล การวิเคราะห์และรายงานผล การควบคุมและการประกันคุณภาพ รวมถึงการทดสอบความชํานาญทางห้องปฏิบัติการ 2. นิยาม ความหมายของคําที่ใช้ในมาตรฐานสินค้าเกษตรนี้ มีดังต่อไปนี้ 2.1 ยาต้านจุลชีพหรือสารต้านจุลชีพ (antimicrobial agent) หมายถึง สารที่เกิดตามธรรมชาติ หรือสารกึ่งสังเคราะห์หรือสังเคราะห์ มีคุณสมบัติในการฆ่าหรือยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลชีพ เมื่อมีความเข้มข้นที่เหมาะสม ซึ่งไม่รวมถึงยาถ่ายพยาธิและยาป้องกันโรคบิด (antiparasitic and anticoccidial agents) หรือสารจําพวกเดียวกันที่ใช้ในการฆ่าเชื้อและทําความสะอาด 2.2 การทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ (bacterial antimicrobial susceptibility testing) หมายถึง วิธีการทดสอบลักษณะทางฟีโนไทป์ของแบคทีเรียในหลอดทดลอง เพื่อจําแนกการตอบสนอง ของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพที่มีความเข้มข้นเดียวกับระดับของยาต้านจุลชีพในเลือดหรือเนื้อเยื่อ ซึ่งแปลผลการทดสอบเป็น ไวรับ (susceptible) กึ่งดื้อยา (intermediate) หรือดื้อยาต้านจุลชีพ (resistant) 2.3 การดื้อยาต้านจุลชีพ (antimicrobial resistance) หมายถึง ความสามารถของจุลชีพในการเพิ่มจํานวน หรือมีชีวิตอยู่ในสภาวะที่มียาต้านจุลชีพในระดับความเข้มข้นที่สูงกว่าระดับที่เคยใช้ในการฆ่า หรือยับยั้งจุลชีพชนิดนั้นได้

มกษ . 9065-2566 2 2.4 MIC (minimum inhibitory concentration) หมายถึง ค่าความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพในระดับตํ่าสุด ที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจนไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า 2.5 ค่าจุดตัดความไวต่อยา (clinical breakpoint; CBP) หมายถึง ค่า MIC หรือเส้นผ่านศูนย์กลางของ บริเวณที่ยับยั้งการเจริญเติบโต (inhibition zone diameter) ของแบคทีเรีย ที่ใช้จัดหมวดหมู่ความไว ของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ 2.6 Epidemiological cut-off value (ECOFF หรือ ECV) หมายถึง ค่า MIC ที่ใช้แบ่งกลุ่มแบคทีเรีย ออกเป็นกลุ่มแบคทีเรีย wild type และกลุ่มแบคทีเรีย non-wild type ( ได้รับยีนดื้อยาหรือ มีการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยา ) กําหนดได้จากการกระจายตัวของค่า MIC (MIC distribution) และใช้จัดกลุ่มแบคทีเรียในการตรวจติดตามและเฝ้าระวังเชื้อดื้อยา 2.7 หมวดหมู่ความไวต่อยาต้านจุลชีพ (interpretive category) หมายถึง หมวดหมู่ที่จัดให้ค่า MIC หรือ inhibition zone diameter อยู่ในช่วงไวรับ กึ่งดื้อยา หรือดื้อยา 2.8 การคัดเลือกร่วม (co-selection) หมายถึง การคัดเลือกยีนดื้อยายีนใดยีนหนึ่งที่ส่งผลให้เกิด การคัดเลือกของยีนดื้อยาอื่นๆ หลายยีนพร้อมกัน 2.9 การดื้อยาร่วม (co-resistance) หมายถึง ความสามารถของจุลชีพในการเพิ่มจํานวนหรือมีชีวิต อยู่ในสภาวะที่มียาต้านจุลชีพได้มากกว่าหนึ่งกลุ่ม เนื่องจากมีกลไกการดื้อยาที่หลากหลาย 2.10 การดื้อยาข้าม (cross-resistance) หมายถึง ความสามารถของจุลชีพในการเพิ่มจํานวนหรือมีชีวิตอยู่ ในสภาวะที่มียาต้านจุลชีพได้มากกว่าหนึ่งชนิด ซึ่งเป็นยาที่อยู่ในกลุ่มเดียวกัน หรือมีการดื้อยาข้าม ไปยังยากลุ่มอื่นๆ ที่ใช้กลไกการดื้อยาร่วมกัน 3. การทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ เชื้อดื้อยาเป็นปัญหาสําคัญด้านสาธารณสุขและสุขภาพสัตว์ และการใช้ยาต้านจุลชีพที่ไม่เหมาะสม เป็นปัจจัยที่อาจส่งผลให้แบคทีเรียเกิดการดื้อยาต้านจุลชีพ ซึ่งการทดสอบความไวของแบคทีเรีย ต่อยาต้านจุลชีพ มีจุดประสงค์เพื่อประมาณการตอบสนองของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพที่ใช้ ในการรักษา รวมถึงนําไปประกอบการเฝ้าระวังและตรวจติดตามการเกิดเชื้อดื้อยา เพื่อให้ทราบถึงสถานการณ์ของการเกิด การแพร่กระจาย และวิทยาการระบาดของเชื้อดื้อยาในปศุสัตว์ ที่เลี้ยงไว้เพื่อการบริโภค จําเป็นต้องปรับประสานแนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรีย ต่อยาต้านจุลชีพ และการรายงานผลให้เป็นแนวทางเดียวกัน ซึ่งจะเป็นประโยชน์ต่อการเปรียบเทียบ และรวบรวมข้อมูลระหว่างห้องปฏิบัติการด้านการเฝ้าระวังและตรวจติดตามเชื้อดื้อยาในปศุสัตว์ เพื่อนําไปใช้ประกอบการกําหนดนโยบายทางด้านสุขภาพสัตว์และมนุษย์ด้านการจัดการเชื้อดื้อยาต่อไป 3.1 ข้อแนะนําสําหรับห้องปฏิบัติการในการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ เพื่อให้วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพมีมาตรฐานเดียวกัน และสามารถนําผลไปใช้ เปรียบเทียบได้ ห้องปฏิบัติการควรดําเนินการดังนี้

3 มกษ . 9065-2566 3.1.1 เลือกใช้วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพที่เป็นวิธีมาตรฐาน และมีการควบคุม คุณภาพภายในห้องปฏิบัติการ 3.1.2 วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพทุกวิธีต้องให้ผลที่ถูกต้องและมีความเที่ยงตรง 3.1.3 กําหนดเกณฑ์ที่ใช้ในการแปลผลให้ชัดเจน และห้องปฏิบัติการต่างๆ นําเกณฑ์ดังกล่าวไปใช้ 3.1.4 ควรทําการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพด้วยวิธีเชิงปริมาณ เช่น การตรวจหาค่า MIC 3.1.5 ควรบันทึกผลค่า inhibition zone diameter และ MIC ในเชิงปริมาณ 3.1.6 ควรมีระบบบริหารคุณภาพ 3.1.7 ควรได้รับการรับรองมาตรฐานระบบการจัดการคุณภาพของห้องปฏิบัติการ 3.1.8 ใช้เชื้อมาตรฐานหรือเชื้ออ้างอิงในการควบคุมคุณภาพภายในห้องปฏิบัติการ การประกันคุณภาพ และการทดสอบความชํานาญทางห้องปฏิบัติการ 3.1.9 มีการประสานงานทางด้านเทคนิค การแปลผล และการควบคุมคุณภาพ เพื่อให้มั่นใจว่าผลการทดสอบ มีความถูกต้องและเที่ยงตรง 3.2 การเลือกวิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ 3.2.1 ปัจจุบันการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพจากลักษณะทางฟีโนไทป์มีหลายวิธี ( ภาคผนวก ก ) ดังนั้นควรเลือกวิธีทดสอบที่ได้รับการยืนยันความใช้ได้และเหมาะสมกับชนิดของ แบคทีเรียที่ต้องการทําการทดสอบ 3.2.2 ให้คํานึงถึงปัจจัยต่างๆ เช่น ความสะดวกในการปฏิบัติงาน การปรับเปลี่ยนเป็นระบบอัตโนมัติ ค่าใช้จ่าย ความสามารถในการทําซํ้า ความน่าเชื่อถือและความแม่นยํา ความเหมาะสมในการนําไปใช้ ปฏิบัติงานตามวัตถุประสงค์ 3.2.3 เป็นวิธีมาตรฐานของ Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) หรือ International Organization for Standardization (ISO) ซึ่งได้รับการยอมรับระหว่างประเทศ 3.3 การเลือกยาต้านจุลชีพที่ใช้ในการทดสอบ เลือกยาต้านจุลชีพที่จะใช้ในการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพให้เหมาะสม ดังนี้ 3.3.1 เป็นยาต้านจุลชีพที่องค์การอนามัยโลก (World Health Organisation; WHO) จัดให้อยู่ในรายการ ยาต้านจุลชีพที่มีความสําคัญทางการแพทย์ (WHO list of critically important antimicrobials for human medicine) หรือเป็นยาต้านจุลชีพที่องค์การสุขภาพสัตว์โลก (World Organisation for Animal Health; WOAH) แนะนํา 3.3.2 จํานวนและชนิดของยาต้านจุลชีพที่ใช้ในการทดสอบให้เป็นไปตามมาตรฐานของ CLSI หรือ EUCAST และอย่างน้อยต้องมีตัวแทนของยาต้านจุลชีพในกลุ่มที่ WHO หรือ WOAH แนะนํา

มกษ . 9065-2566 4 3.3.3 รายการยาต้านจุลชีพที่ใช้ในการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพให้เป็นไปตาม แผนการเฝ้าระวังและตรวจติดตามเชื้อดื้อยาของประเทศ และมีความเหมาะสมกับชนิดของ แบคทีเรียเป้าหมายที่ต้องทําการเฝ้าระวังและตรวจติดตามเชื้อดื้อยา เพื่อให้การดําเนินงานเป็นไป อย่างต่อเนื่อง ได้ข้อมูลที่สามารถนําไปเปรียบเทียบกันได้ และใช้ตรวจติดตามรูปแบบของการดื้อยา ที่อาจเปลี่ยนแปลงไป 3.3.4 เลือกชนิดยาต้านจุลชีพตามลําดับความสําคัญ โดยเรียงลําดับจากผลต่อสุขภาพมนุษย์ สถานการณ์ ในประเทศ และให้รวมยาต้านจุลชีพที่มักพบการดื้อยาร่วมหรือการดื้อยาข้ามไว้ในรายการยาต้านจุลชีพ ที่ใช้ในการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ 3.3.5 ในการเฝ้าระวังและตรวจติดตามเชื้อดื้อยา ให้ใช้ยาต้านจุลชีพชนิดเดียวกันทดสอบความไว ของแบคทีเรียที่แยกได้จากตัวอย่างในแต่ละขั้นตอนของกระบวนการผลิตตลอดโซ่การผลิต 3.3.6 แบคทีเรียบางชนิดสามารถดื้อยาบางกลุ่มได้ตามธรรมชาติ (intrinsic resistance) จึงไม่จําเป็น ต้องนํายากลุ่มนั้นมาใช้ในการทดสอบ เพื่อไม่ให้เกิดความผิดพลาดในการแปลผล ทั้งนี้ประเภท ของการดื้อยาตามธรรมชาติของแบคทีเรียที่ทําการทดสอบ ให้พิจารณาจากเอกสารทางวิชาการ หรือจากผลการทดสอบอื่นๆ 3.3.7 เนื่องจากอาจพบอุบัติการณ์หรือกลไกของการดื้อยารูปแบบใหม่เกิดขึ้น ควรทบทวนค่า CBP และเกณฑ์การแปลผลของการทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพของแบคทีเรียตามเกณฑ์มาตรฐานที่ เป็นปัจจุบัน 3 . 4 ช่วงความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพ เลือกช่วงความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพแต่ละชนิดที่ครอบคลุมค่า CBP หรือ ECOFF และช่วง ความเข้มข้นของการทดสอบด้วยเชื้ออ้างอิง และสอดคล้องกับข้อมูลความไวต่อยาต้านจุลชีพในมนุษย์ 3 . 5 เกณฑ์การแปลผล ผลจากการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพด้วยวิธี dilution method หรือ disk diffusion จําแนกออกเป็น ไวรับ กึ่งดื้อยา และดื้อยา ตามเกณฑ์การจัดหมวดหมู่ความไวต่อยาต้านจุลชีพ (interpretive criteria) ซึ่งกําหนดด้วยวิธีมาตรฐานและใช้แนวทางเดียวกัน ดังนี้ 3.5.1 ใช้เชื้ออ้างอิงเพื่อควบคุมคุณภาพของวิธี dilution method หรือ disk diffusion โดย MIC หรือช่วงของ inhibition zone diameter ให้อยู่ในช่วงการควบคุมคุณภาพ (quality control range)

5 มกษ . 9065-2566 3.5.2 บันทึกผลการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพในเชิงปริมาณ ได้แก่ 1) ค่า MIC ในหน่วย มิลลิกรัมต่อลิตร (mg/l) 1/ หรือไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (μg/ml) 2/ 2) ค่า inhibition zone diameter ในหน่วยมิลลิเมตร (mm) 3/ 3.5.3 แปลผลความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพโดยใช้หลักเกณฑ์ตามลําดับดังนี้ 1) CBP ของ CLSI ในกรณีที่ไม่มีค่า CBP จาก CLSI ให้แปลผลตามค่า CBP จาก EUCAST 2) ECOFF ของ EUCAST 3) กรณียาต้านจุลชีพที่ทดสอบไม่มีทั้งค่า CBP และ ECOFF ให้อ้างอิงค่าที่ใช้ในการแปลผลจาก เอกสารทางวิชาการ พร้อมทั้งระบุแหล่งที่มาของเอกสารที่ใช้อ้างอิง 3.5.4 หากแปลผลด้วย ECOFF ให้แบ่งกลุ่มแบคทีเรียออกเป็น 2 กลุ่ม ได้แก่ กลุ่มแบคทีเรีย wild-type ที่ไม่พบกลไกการดื้อยาจากการแสดงออกทางลักษณะทางฟีโนไทป์ และกลุ่มแบคทีเรีย non-wild type ที่พบกลไกการดื้อยาจากการแสดงออกทางลักษณะทางฟีโนไทป์ พร้อมรายงานผลการกระจายตัว ของค่า MIC 3 . 6 ข้อแนะนําสําหรับการปฏิบัติงานในการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ เพื่อลดปัจจัยที่ส่งผลต่อความแม่นยําและเที่ยงตรงของการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ มีข้อแนะนําในการปฏิบัติงานดังนี้ 3.6.1 จัดทําเอกสารขั้นตอนการปฏิบัติงาน และบันทึกข้อมูลการปฏิบัติงานในแต่ละขั้นตอน 3.6.2 แบคทีเรียที่ใช้ในการทดสอบต้องเป็นเชื้อบริสุทธิ์ที่เพาะแยกได้จากตัวอย่างที่ส่งตรวจ 3.6.3 จําแนกแบคทีเรียด้วยวิธีมาตรฐานโดยระบุสกุล และสปีชีส์ 3.6.4 เก็บรักษาสภาพแบคทีเรียด้วยวิธีที่เหมาะสม 3.6.5 ในขั้นตอนการทดสอบ ให้ใช้เชื้อบริสุทธิ์ที่ได้จากการเพาะบ่มไม่เกิน 24 ชั่วโมง ไปเตรียมความเข้มข้น ของกล้าเชื้อ (inoculum) ของแบคทีเรียที่จะทดสอบให้อยู่ในระดับมาตรฐาน โดยการวัดความขุ่น ด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (spectrophotometer) หรือมาตรความขุ่น (nephelometer) เพื่อให้มี ปริมาณแบคทีเรียที่เหมาะสมสําหรับนําไปใช้ในการทดสอบ 3.6.6 เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง (agar) และอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลว (broth) ตามที่กําหนดไว้ใน มาตรฐานของ CLSI หรือ EUCAST หรือ ISO 1 / mg/l เป็นคําย่อสําหรับหน่วยที่ยอมรับให้ใช้ได้กับระบบเอสไอ (International System of units; SI) ที่ใช้แทนคําว่า “ มิลลิกรัมต่อลิตร (milligram per liter)” 2 / μg/ml เป็นคําย่อสําหรับหน่วยที่ยอมรับให้ใช้ได้กับระบบเอสไอ (International System of units; SI) ที่ใช้แทนคําว่า “ ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (microgram per milliliter)” 3 / mm เป็นสัญลักษณ์สําหรับหน่วยที่ยอมรับให้ใช้ได้กับระบบเอสไอ (International System of units; SI) ที่ใช้แทนคําว่า “ มิลลิเมตร (millimeter)

มกษ . 9065-2566 6 3.6.7 ความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพและระยะเวลาที่ใช้ทดสอบให้เป็นไปตามมาตรฐานของ CLSI หรือ EUCAST หรือ ISO และมีความเหมาะสมกับชนิดแบคทีเรียที่ทําการทดสอบ 3.6.8 ใช้ตัวทําละลาย (solvents) และสารเจือจาง (diluents) ที่เหมาะสม ทั้งชนิด ปริมาณ และสัดส่วน ในการเตรียมสารละลายตั้งต้น (stock solution) ของยาต้านจุลชีพ 3.6.9 ควบคุมสภาวะของตู้บ่มเชื้อ และระยะเวลาที่ใช้เพาะบ่มเชื้อ 3.6.10 มีชุดควบคุมคุณภาพการทดสอบ รวมถึงเชื้ออ้างอิง 3.6.11 ให้ใช้เทคนิคปลอดเชื้อตลอดขั้นตอนการทดสอบ 3.6.12 บันทึกข้อมูลดิบในเชิงปริมาณ ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการเปรียบเทียบหรือแลกเปลี่ยนข้อมูล นอกจากนี้สามารถนําข้อมูลไปวิเคราะห์ย้อนหลัง หรือนําไปใช้ในการประเมินความเสี่ยงได้ โดยเฉพาะ กรณีที่มีการเปลี่ยนแปลง CBP หรือ ECOFF 3 . 7 วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ เพื่อให้ได้ผลการทดสอบที่สอดคล้องกันระหว่างห้องปฏิบัติการ แนะนําให้เลือกใช้วิธีการทดสอบความไว ของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ ดังต่อไปนี้ 3.7.1 Dilution method Dilution method ประกอบด้วยวิธี broth dilution และ agar dilution โดยจุดประสงค์ของการเลือกใช้ วิธี broth dilution และ agar dilution เพื่อให้ทราบระดับความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพที่ตํ่าสุด ที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจนไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า ซึ่งอาจเป็น การทดสอบในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลวหรืออาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง ห้องปฏิบัติการควรกําหนดช่วง MIC ของยาต้านจุลชีพแต่ละชนิดที่นําไปใช้ในการทดสอบ โดยให้เลือก ช่วงความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพที่ครอบคลุมค่า CBP ( ไวรับ กึ่งดื้อยา และดื้อยา ) สําหรับแบคทีเรีย ที่ต้องการทดสอบ รวมถึงช่วงความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพสําหรับเชื้ออ้างอิงที่ใช้ในการควบคุมคุณภาพ นอกจากนี้ห้องปฏิบัติการควรจัดทําคู่มือการปฏิบัติงานสําหรับการเก็บรักษายาต้านจุลชีพที่เป็น สารละลายตั้งต้น และเตรียมสารละลายสําหรับการทดสอบ (working solution) 3.7.1.1 Broth microdilution วิธีนี้ใช้ทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อระดับความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพในช่วงต่างๆ โดยนิยม ใช้การเจือจางยาต้านจุลชีพในอาหารเลี้ยงเชื้อลงสองเท่าตามลําดับ (serial twofold dilution) ในไมโครไตเตอร์เพลต (microtiter plate) แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพให้เป็นไปตามมาตรฐาน CLSI , EUCAST หรือ ISO 20776 - 1 ที่เป็นปัจจุบัน กรณีที่มาตรฐานระหว่างประเทศไม่มีวิธีโดยเฉพาะสําหรับ แบคทีเรียที่ต้องการทดสอบ ให้อ้างอิงวิธีการทดสอบจากเอกสารทางวิชาการที่เป็นปัจจุบัน พร้อมทั้ง ระบุที่มาของเอกสารที่ใช้อ้างอิง

7 มกษ . 9065-2566 3.7.1.2 Agar dilution วิธีนี้ใช้ทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพที่ความเข้มข้นต่างๆ บนอาหารเลี้ยงเชื้อ ชนิดแข็ง แนะนําให้ใช้วิธีนี้ในกรณีที่มีเชื้อจํานวนมากและไม่สามารถทดสอบความไวของแบคทีเรีย ต่อยาต้านจุลชีพด้วยวิธี broth dilution ได้ แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพด้วยวิธี agar dilution ให้เป็นไปตาม มาตรฐาน CLSI ที่เป็นปัจจุบัน กรณีที่มาตรฐานระหว่างประเทศไม่มีวิธีโดยเฉพาะสําหรับแบคทีเรีย ที่ต้องการทดสอบ ให้อ้างอิงวิธีการทดสอบจากเอกสารทางวิชาการที่เป็นปัจจุบัน พร้อมทั้งระบุที่มา ของเอกสารที่ใช้อ้างอิง 3.7.2 Disk diffusion วิธีนี้ใช้แผ่นยา (antibiotic disk) ที่ทราบปริมาณความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพวางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ชนิดแข็งที่ใส่เชื้อบริสุทธิ์ไว้ หลังการเพาะเชื้อจะทําการวัดขนาด inhibition zone diameter รอบแผ่นยา อย่างไรก็ตามไม่แนะนําให้ใช้วิธีนี้กับยาต้านจุลชีพที่มีโมเลกุลใหญ่ เช่น ยาโคลิสติน (colistin) ยาพอลีไมซินบี (polymyxin B) เนื่องจากมีการแพร่กระจายของยาในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็งได้ไม่ดี แนวทางการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพด้วยวิธี disk diffusion ให้เป็นไปตาม มาตรฐาน CLSI และ EUCAST ที่เป็นปัจจุบัน กรณีที่มาตรฐานระหว่างประเทศไม่มีวิธีโดยเฉพาะ สําหรับแบคทีเรียที่ต้องการทดสอบ ให้อ้างอิงวิธีการทดสอบจากเอกสารทางวิชาการที่เป็นปัจจุบัน พร้อมทั้งระบุที่มาของเอกสารที่ใช้อ้างอิง 3.8 การบันทึกและเก็บรักษาข้อมูล 3.8.1 ให้บันทึกและเก็บรักษาข้อมูลที่สําคัญ ดังนี้ 1) ข้อมูลทางห้องปฏิบัติการ เช่น รายละเอียดของห้องปฏิบัติการ หมายเลขแบคทีเรียที่แยกได้ (bacterial isolate number) ชนิดและสายพันธุ์ของแบคทีเรีย วิธีการทดสอบความไวของ แบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพที่ใช้ สถานที่เก็บรักษาแบคทีเรีย รวมถึงชนิดและแหล่งที่มา ของตัวอย่าง 2) ผลทดสอบทางห้องปฏิบัติการในเชิงปริมาณ รวมถึงระบุรายละเอียดของวิธีที่ใช้ในการทดสอบ เชื้ออ้างอิง เกณฑ์การจัดหมวดหมู่ความไวต่อยาต้านจุลชีพ และยาต้านจุลชีพที่ใช้ เช่น ผลความไวต่อ ยาต้านจุลชีพ เชื้อดื้อยาที่ตรวจพบ ค่า MIC ของแบคทีเรียที่แยกได้ ขนาดของ inhibition zone diameter ทั้งนี้ เพื่อให้หน่วยงานที่เกี่ยวข้องนําข้อมูลและบันทึกที่ได้จากห้องปฏิบัติการไปวิเคราะห์และวางแผน ด้านการเฝ้าระวังและตรวจติดตามเชื้อดื้อยาระดับประเทศ 3.8.2 ให้จัดเก็บข้อมูลในรูปแบบอิเล็กทรอนิกส์และเอกสาร

มกษ . 9065-2566 8 3.9 การวิเคราะห์และรายงานผล 3.9.1 วิเคราะห์และรายงานผลการทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพเป็นร้อยละของจํานวนแบคทีเรียที่ไวรับ กึ่งดื้อยา หรือดื้อยา และค่า MIC ของแบคทีเรียที่แยกได้ หรือขนาดของ inhibition zone diameter ซึ่งจะเป็นประโยชน์เมื่อมีการเปลี่ยนแปลงหลักเกณฑ์ที่ใช้ในการแปลผล 3.9.2 รายงานผลความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพตามชนิดยาและจํานวนกลุ่มยาต้านจุลชีพที่ทดสอบ เพื่อนําไปใช้ในการเฝ้าระวังการดื้อยาหลายชนิดพร้อมกัน (multidrug resistance) 3.9.3 ห้องปฏิบัติการรวบรวบข้อมูลเพื่อจัดทํารายงานประจําปี 3.10 การควบคุมและการประกันคุณภาพ ห้องปฏิบัติการด้านการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพจัดทําระบบควบคุมและ ประกันคุณภาพ ดังนี้ 3.10.1 มีโปรแกรมการประกันคุณภาพ เช่น การตรวจติดตาม การบันทึกข้อมูล การตรวจประเมิน การแก้ไข ข้อบกพร่อง การสอบเทียบและบํารุงรักษาเครื่องมือ การทดสอบความชํานาญทางห้องปฏิบัติการ การฝึกอบรม และการควบคุมคุณภาพ ซึ่งจะทําให้มั่นใจว่าผลการทดสอบมีความถูกต้อง 3.10.2 ควบคุมคุณภาพด้วยเทคนิคการปฏิบัติงาน เพื่อให้มั่นใจว่าวิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรีย ต่อยาต้านจุลชีพมีความถูกต้องและเที่ยงตรง 3.10.3 ตรวจติดตามความถูกต้องและเที่ยงตรงของกระบวนการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ การรับรองความสามารถห้องปฏิบัติการ ความชํานาญของผู้ปฏิบัติงานและผู้แปลผล รวมถึงคุณภาพ สารเคมี 3.10.4 ปฏิบัติงานตามคู่มือการปฏิบัติงานควบคู่ไปกับการควบคุมภาพอาหารเลี้ยงเชื้อและสารเคมีที่ใช้ 3.10.5 บันทึกข้อมูลอุปกรณ์ที่สําคัญ เช่น รุ่นการผลิต การสอบเทียบเครื่องมือ การตรวจติดตามคุณภาพ ตามข้อกําหนดเฉพาะของการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ 3.10.6 บันทึกข้อมูลสารเคมีที่สําคัญ เช่น รุ่นการผลิต วันหมดอายุ การตรวจติดตามคุณภาพ ตามข้อกําหนดเฉพาะ ของการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ 3.10.7 ใช้เชื้ออ้างอิงในการควบคุมคุณภาพ ซึ่งเป็นเชื้ออ้างอิงที่มาจากแหล่งที่น่าเชื่อถือ เช่น American Type Culture Collection (ATCC) เชื้ออ้างอิงที่มีการจําหน่ายทางการค้าที่มีความน่าเชื่อถือ เชื้ออ้างอิง ที่มีวิธีการเก็บรักษาและวิธีใช้ที่ถูกต้อง 3.10.8 จัดกลุ่มเชื้ออ้างอิง และตรวจความคงที่ของฟีโนไทป์ของเชื้ออ้างอิงเมื่อนําไปทดสอบความไว ของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพพร้อมจัดทําบันทึกข้อมูลของเชื้ออ้างอิง ประกอบด้วย การดื้อยา ช่วงความเข้มข้นของยาต้านจุลชีพที่ทดสอบ วิธีที่ใช้ในการทดสอบ 3.10.9 เลือกชนิดเชื้ออ้างอิงที่เหมาะสมและครอบคลุมต่อการนําไปทดสอบความไวของแบคทีเรีย ต่อยาต้านจุลชีพ

9 มกษ . 9065-2566 3.10.10 เก็บรักษา stock culture ของเชื้ออ้างอิงไว้ และจัดแบ่งเชื้อไว้เป็น working culture เพื่อลดการปนเปื้อน 3.10.11 เมื่อมีการเปลี่ยนรุ่นการผลิตอาหารเลี้ยงเชื้อ เพลต หรือแผ่นยาใหม่ ให้นําไปทดสอบกับเชื้ออ้างอิง ตามวิธีมาตรฐานทุกครั้งก่อนนําไปใช้ 3.10.12 มีการดําเนินงานตามระบบชีวนิรภัยของห้องปฏิบัติการ และมีการทําลายเชื้อที่เหมาะสม 3.11 การทดสอบความชํานาญทางห้องปฏิบัติการ ควรมีการประกันคุณภาพห้องปฏิบัติการโดยองค์กรภายนอก และผู้ปฏิบัติงานได้รับการทดสอบ ความชํานาญในการตรวจวิเคราะห์ ทั้งนี้ สนับสนุนให้ห้องปฏิบัติการเข้าร่วมการเปรียบเทียบผลทดสอบ ระหว่างห้องปฏิบัติการระดับประเทศและระหว่างประเทศ

มกษ . 9065-2566 10 ภาคผนวก ก ( ให้ไว้เป็นข้อมูล ) วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพ จากลักษณะทางฟีโนไทป์ การเลือกวิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพควรคํานึงถึงความเหมาะสมของวิธีที่ใช้ กลุ่มประชากรสัตว์เป้าหมายที่ต้องการเฝ้าระวังและตรวจติดตามเชื้อดื้อยา รวมถึงวิธีที่ใช้เก็บตัวอย่าง ปัจจุบันการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพจากลักษณะทางฟีโนไทป์มีหลายวิธี ดังนี้ ตารางที่ ก .1 วิธีการทดสอบความไวของแบคทีเรียต่อยาต้านจุลชีพจากลักษณะทางฟีโนไทป์ ( ข้อ 3.2.1) วิธี มาตรฐาน ระหว่าง ประเทศ ค่าจุดตัด ความไวของยา ผลที่ได้จาก การทดสอบ การเทียบผล ระหว่าง ห้องปฏิบัติการ การนําไปใช้และข้อแนะนํา Broth micro dilution CLSI EUCAST ISO 20776-1 Clinical breakpoint (CBP) หรือ Epidemiological cut-off values (ECOFF) Minimum inhibitory concentration (MIC) นําค่า MIC ไปรวมและ เทียบกันได้ - เป็นวิธีอ้างอิง - นิยมใช้สําหรับแผนการเฝ้า ระวังเชื้อดื้อยาระดับประเทศ - ค่า MIC บ่งบอกแนวโน้ม ของกลไกการดื้อยาได้ - เป็นวิธีเดียวที่ใช้สําหรับ ทดสอบ AST ของยาโคลิสติน ในปัจจุบัน Agar dilution CLSI EUCAST CBP หรือ ECOFF MIC ขึ้นกับ ความสอดคล้อง ของวิธีที่ใช้ - เป็นวิธีอ้างอิง - นิยมใช้สําหรับแผนการเฝ้า ระวังเชื้อดื้อยาระดับประเทศ - ค่า MIC บ่งบอกแนวโน้ม ของกลไกการดื้อยาได้ - ค่าจุดตัดความไวของยา จากวิธี broth microdilution ไม่สามารถนํามาใช้กับวิธี agar dilution ได้โดยตรง

11 มกษ . 9065-2566 วิธี มาตรฐาน ระหว่าง ประเทศ ค่าจุดตัด ความไวของยา ผลที่ได้จาก การทดสอบ การเทียบผล ระหว่าง ห้องปฏิบัติการ การนําไปใช้และข้อแนะนํา Disk diffusion CLSI EUCAST CBP ขนาดของ inhibition zone diameter ขึ้นกับ ความสอดคล้อง ของวิธีที่ใช้ - อาจนําไปใช้ในการเฝ้า ระวังเชื้อดื้อยาได้ - นิยมนําไปใช้สําหรับวัตถุ ประสงค์ในการรักษาโรค - ขนาดของเส้นผ่าน ศูนย์กลางจะแตกต่างกัน ขึ้นกับเทคนิคที่ใช้ - ขนาดของเส้นผ่าน ศูนย์กลางสามารถบ่งบอก ถึงการเปลี่ยนแปลงความไว ต่อยาต้านจุลชีพได้ - นําไปใช้ร่วมกับวิธีอื่นที่มี ค่า CBP เดียวกัน ที่มา : WOAH. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2019. Chapter 2.1.1. Laboratory methodologies for bacterial antimicrobial susceptibility testing.